热点 | 中美同时报道肿瘤液体活检新靶标，诊断准确率超90%

近日，美国芝加哥大学何川教授，上海复旦大学附属华山医院刘杰教授，与北京协和医院等国内多家单位合作发表于Cell Res的研究报道，利用何川教授发明的专利技术，特异性检测结直肠癌、胃癌等多种肿瘤血中的循环游离DNA（cfDNA） 的一种新型修饰（5-羟甲基胞嘧啶，5hmC），灵敏度与特异性均达到90%左右。无独有偶，美国科学院院士Stephen Quake教授与斯坦福医学院、四川华西医院等使用相同技术原理合作发表于Cell Res的另一项研究，也阐述了这一检测的重大临床应用潜力。cfDNA 5hmC 检测是什么，为何引起了如此多的国际国内学者的共同关注？让我们从液体活检说起。

液体活检：肿瘤诊疗的颠覆性变革

液体活检（liquid biopsy），即基于人体体液（主要是血液）中肿瘤的蛛丝马迹来检测全身肿瘤状态的新兴技术，与基于肿瘤组织的创伤活检方法相比，液体活检具有无创、简单、可重复性高等优点，更重要的是避免了因肿瘤异质性带来的组织活检用于基因型检测的不一致性，从而迅速成为精准医学时代的宠儿。如能通过一管血完成肿瘤临床诊疗的全程管理，毫无疑问将为肿瘤诊疗带来颠覆性的变革。

正因为此，液体活检技术被《麻省理工科技评论》（MIT Technology Review ）评为2015 年度十大突破技术，并被美国临床肿瘤学会（ASCO）作为能够改变未来十年癌症治疗的重要进展写入2015年度进展报告。

液体活检新靶标：cfDNA 5hmC检测

cfDNA是由肿瘤细胞死亡、凋亡或主动分泌进入血液循环系统的DNA片段，含有原发肿瘤的突变信息，在cfDNA上能检测出基因点突变、拷贝数免疫、基因重组、外泌体中的 DNA，以及甲基化、羟甲基化表观遗传学改变，可被定性、定量和追踪，用于多种肿瘤的早期诊断和实时监控与评估病情。因此被作为新一代的肿瘤生物标志物。

5hmC （5-hydroxymethylcyto-

sine, 5-羟甲基胞嘧啶）是一种重要的DNA修饰方式，已经发现5hmC可作为重要的表观遗传学标志物，与肿瘤的发生发展密切相关。研究显示，正常组织与肿瘤组织中5hmC的表达水平有显著差异，且不同来源的肿瘤（如肺、结肠、胃、肝、卵巢、胰腺）会释放不同5hmC修饰的cfDNA，提示其可能作为液体活检的候选靶标。

图1. hmC-Seal技术技术在临床样本中的检测

但由于 5hmC 不能使用传统的亚硫酸盐测序法（Bisulfite Sequencing）进行检测，加之血液中cfDNA含量极低，如何实现对微量 5hmC DNA的精确检测，成为限制 5hmC 作为液体活检靶标的重要瓶颈。

何川教授开发的新型的hmC测序技术 5hmC -Seal[Nat Biotechnol 2011]为cfDNA 5hmC 用于液体活检解决了技术难题。 5hmC -Seal首先对测序接头和生物素标记 5hmC 进行连接，然后用链霉亲和素磁珠捕获含 5hmC 的cfDNA，直接进行PCR扩增建库以减少洗脱纯化所致样本损失。经研究者在cfDNA中的优化，该技术可以对低至1,000个细胞 (纳克级DNA) 的样本绘制全基因组5hmC图谱。

cfDNA 5hmC用于肿瘤检测

通过与复旦大学附属华山医院刘杰教授的合作，并联合国内北京协和医院等多家单位，此次研究共纳入了90例健康人、260例癌症患者（包括80例结直肠癌、71例胃癌、25例肝癌、34例胰腺癌、46例甲状腺癌）和71例胃肠良性疾病。

研究者首次在我国常见肿瘤中展示了cfDNA 5hmC液体活检的巨大潜力。

图2  5hmC可作为结直肠癌的特异性标志物

在结直肠癌中，研究者筛选出989个结直肠癌差异性5hmC位点（图2A）。进一步对筛选出的差异性5hmC建立回归模型，并对两批独立验证cfDNA样品绘制ROC特征曲线，结果提示，差异性cfDNA 5hmC用于结直肠癌诊断的灵敏度、特异度均可达80-90%（图2C、D、E）。其在术后、I、II、III期患者中的假阴性率较低，IV期有低概率的假阴性率（与转移灶对cfDNA 5hmC的影响有关），说明该差异性5hmC能够实现结直肠癌的早期诊断（图2F）。

图3  5hmC作为胃癌的肿瘤标志物

研究者同样在胃癌患者血浆中筛选出了差异性5hmC，其在胃癌诊断中的灵敏度、特异度亦可达到90%(图3C、D、E)，并且能够实现结胃癌的早期诊断（图3F）。

研究者还在PDX小鼠模型中证实了cfDNA 5hmc的来源。PDX全称为源于患者原代肿瘤组织的肿瘤移植模型，是当前临床前药效评估和生物标志物鉴定的最佳模型。研究者利用5hmC技术捕获PDX小鼠血浆中的人源cfDNA序列，结果显示，胃癌、肠癌PDX小鼠模型血浆中的人源cfDNA序列比例明显高于对照小鼠，PDX模型中的血浆cfDNA 5hmC与供体肿瘤DNA 5hmC来源一致，患者血浆cfDNA差异性5hmC水平与PDX模型cfDNA水平一致，充分表明了患者游离血浆中5hmC的肿瘤来源。

5hmC作为一种稳定的新型修饰位点，能够在早期癌症患者cfDNA中进行检测，是作为液体活检无创诊断的一个重大突破。中美学者合作证实，差异性5hmC是一种灵敏度、特异度高的肿瘤无创诊断标志物，而且具有较高的组织特异性，是DNA修饰诊断的又一新硕果。

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