CRISPR基因编辑技术是“魔剪”还是“乱箭”？——专访赛业生物科技副总裁欧阳应斌博士

最近，相信很多人都关注到了关于“魔剪”CRISPR引发大规模“意外”脱靶效应的新闻。一篇发表在《自然》子刊Nature Methods上的论文给这一生命科学领域的“大明星”带了不小的负面新闻。

借助全基因组测序，研究人员发现，这一革命性的基因组编辑技术能够引入数百种意想不到的突变到基因组中。探索君也在第一时间对这篇论文进行了报道。

具体来说，该研究中，科学家们对先前经受过CRISPR基因编辑的小鼠进行了全基因组测序。结果发现，两只接受了基因治疗的小鼠的基因组中存在超过1500个单核苷酸突变以及超过100处更大片段的缺失和插入。需要强调的是，这些DNA突变都没有被计算机算法预测出来。

论文共同作者称，没有使用全基因组测序来寻找脱靶效应的研究人员可能会错过潜在的重要突变。即使是一个单个核苷酸变化也会产生巨大的影响。

这篇论文的发表引发了不小的轰动。那么，究竟这是不是一篇值得“恐慌”的论文？CRISPR技术的应用是否会受到很大的影响？近日，记者采访了赛业生物科技技术副总裁、高级科学家欧阳应斌博士。他说：“目前，CRISPR临床应用的安全性是完全不具备的，我们必须投入巨大的资源去把脱靶的真正原因找出来，并设计出有效对策。”

以下是采访实录：

记者：能否请您先介绍一下这一备受瞩目的基因组编辑技术的由来？

欧阳博士：20年前，日本科学家石野良純在克隆一个目的基因时偶然发现一种特别的重复序列；随后10年，研究人员一直在试图破解这种存在于很多细菌和古细菌的神秘序列，并给它冠以CRISPR这么个古怪的名称。CRISPR的“神秘面纱”直到10年前才开始被逐步揭开。原来它是一种以病毒DNA序列为精准打击对象的“导弹防御系统”。

近几年，以MIT张锋实验室为首的科学家小组把这种进化论产生的生物“武器”用在了各个物种的基因改造上，包括果蝇、斑马鱼、老鼠、猴子等。这一便捷高效的基因组编辑工具成为了生命科学研究中前所未有的“利器”。我们甚至可以利用这把“利器”来纠正人类的基因缺陷。一些致力于利用CRISPR技术治疗疾病的公司很快诞生了。目前，已有多家这类公司在美国上市。

记者：据了解，脱靶效应是CRISPR系统一直存着的问题。为什么此次Nature Methods上的这篇论文会引起这么大的“反应”？

欧阳博士：一直以来，关于CRISPR脱靶效应的文章就层出不穷。一些文章称，应该重视脱靶效应，但也有文章称，其实脱靶效应危害不大，是可控的。此外，张锋博士还提供了预测脱靶效应的免费“神器”。

之所以这篇论文反响会如此大，是因为这次发现的问题彻底颠覆了之前大家对CRISPR脱靶效应的普遍看法。最突出的问题是，之前大家关注的脱靶主要是插入/缺失突变indel（insertion & deletion），而这次发现最多的脱靶却是点突变SNV（single-nucleotide variant）。每只鼠有大约1700个点突变加上100多个indel。更匪夷所思的是，这些SNV和indel发生的位置都不在预测出来的脱靶位点上。

记者：您刚刚也提到，之前有很多关于CRISPR脱靶效应的文章。为什么，只有这篇文章才发现“大量点突变”的问题？

欧阳博士：这个我也感到很不可思议。我的猜测是，大家一直没有往这个方向想，而且之前的测序深度不够，没有找到更可靠的技术发现点突变。研究者的关注点都集中在预测出来的脱靶位点可能发生的indel。这次用的是50X的深度测序，而且关注点没有局限于脱靶位点和indel，而是拓展到全基因组的各种突变，问题就显现出来了。

记者：这篇文章发表后，也有很多人发出质疑声。他们认为，之所以出现如此大规模的脱靶，可能是gRNA的设计有问题。您怎么看？

欧阳博士：gRNA的设计确实直接影响脱靶，但不管这次的gRNA是如何设计的，我们之前的预测“神器”完全失灵了。预测出来的前50个脱靶位点没有一个发生脱靶。我们原来的认识是：脱靶风险是与gRNA和基因组相关位置之间的同源程度成正比的，这一次我们完全没有看到这种关系。这仿佛是要逼我们重新回到原点，重新审视脱靶的机理，原来的认识可能完全是错误的。

记者：这篇文章是在小鼠上用CRISPR技术做基因突变，暴露了其严重的脱靶效应，但即使如此，我们是不是仍然可以通过一些办法来区分我们设计的基因突变与脱靶突变，继续用CRISPR在小鼠上做基因功能研究？

欧阳博士：脱靶突变给小鼠模型带来的最大问题是我们不知道一个模型的表现型是我们设计的定点基因突变造成的还是我们不知道的某一个脱靶突变造成的。原则上来说，有两种传统办法可以帮助解决这个问题：一个是通过与野生鼠交配去除模型鼠中的脱靶突变，只剩下我们设计的基因突变；另一个是针对同一个模型多做几个line的鼠，看它们的表现型是不是一致的，如果一致，那这表现型就比较可能是我们设计的突变造成的。不幸的是，这篇文章的数据告诉我们，这两种传统办法都无法解决CRISPR脱靶突变的问题。

单说这1700个点突变和100多个indel，分布在每条染色体上平均有好几十个。通过与野生鼠交配去除这些突变是很困难的，因为每一代交配发生在每一条染色体上的同源重组平均也就不到一次，即使把这个突变数降低一个数量级，通过几代的交配来去除，仍然是非常困难的。

更要命的是，这篇文章发现，分别在两个line的老鼠上的这大约1700个点突变和100多个indel大部分都是相同的，所以通过多拿到几个line的小鼠并得到相同的表现型来说明该表现型来自我们设计的基因突变而非脱靶突变是难以成立的。因为不同line的脱靶突变很可能也是一样的。当然深度的二代测序可以告诉我们脱靶的“真相”，但太贵、太耗时了，也不能去除脱靶突变。

记者：那用CRISPR做小鼠的基因突变还可行吗？

欧阳博士：与传统的ES细胞基因打靶技术制备基因工程小鼠相比，CRISPR技术的最大优点是快捷和低成本。但如果脱靶的问题不能解决的话，用该方法来制备基因工程小鼠显然远远没有ES基因打靶可靠，尤其是像条件性基因敲除（cKO）这样复杂昂贵的项目，实在不建议用CRISPR，因为不用花多得太多的代价和时间，完全可以用ES打靶这个久经考验的金标准。我们两年前推出的TurboKnockout技术平台，在传统ES基因打靶上引入了两项重大技术革新，进一步压缩了ES打靶的周期和成本，是加大了这个金标准的优势。我们的人工智能设计网站更是简化了方案的设计，我们的技术完全可以弥补CRISPR的不足。

记者：这篇论文似乎是给CRISPR技术泼了盆冷水。您如何看待这一技术在医疗领域的应用前景？

欧阳博士：至少在医疗领域我看不到近期内的应用前景。目前CRISPR临床应用的安全性是完全不具备的，我们必须投入巨大的资源去把脱靶的真正原因找出来，并设计出有效对策。但我相信，这项技术在科研上仍然不失为一个有用的工具。下一步我们必须找出问题，解决问题。

关于欧阳应斌博士

欧阳应斌（Marvin Ouyang）于1997年开始就职于美国Oklahoma医学研究基金会，担任高级科学家，成功发现、纯化并克隆了两种硫蛋白转移酶，成功建成基因敲除小鼠模型。2002年担任美国Thios生物制药公司生物部高级科学家，推动了硫酸转移酶小分子抑制剂及重组抗体制药的研发。从2004年开始担任美国Taconic生物科技公司分子生物学部主管，率领十余位科学家成功开发建成四百余种转基因小鼠及大鼠实验动物及疾病模型。在PNAS、Mol Cell Biol.、J. Biol. Chem.等高水平杂志发表论文10余篇。欧阳博士于2012年加入赛业生物科技（ Cyagen Biosciences）公司，主要负责转基因鼠及基因敲除小鼠平台的管理及优化。