Small | 上海大学曹亚/贝毅桦/赵婧使用CRISPR-Cas系统协同检测循环RNA及时诊断急性心肌梗死

iNature · 公众号 · · 2024-07-21 00:00

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急性心肌梗死（AMI）是全球主要死亡原因之一，影响全球公众健康。环状核糖核酸（circRNA）是AMI的潜在诊断生物标志物，为及时进行医疗护理提供了有价值的参考。

2024年7月18日，上海大学曹亚、贝毅桦、赵婧共同通讯在 Small 在线发表题为“ Collaborative CRISPR-Cas System-Enabled Detection of Circulating Circular RNA for Reliable Monitoring of Acute Myocardial Infarction ”的研究论文， 该研究基于CRISPR-Cas系统开发了一种检测circRNA的电化学方法。

该系统以等温引物交换反应为桥梁，将独特的circRNA靶向能力与Cas效应子的级联反式切割活性相结合。使用cZNF292，作者鉴定出AMI的循环circRNA生物标志物，基于CRISPR-Cas系统的协作方法具有良好的准确性和灵敏度，检测限低至2.13×10 ⁻¹⁵ 。此外，该方法在分析全血样本时表现出良好的AMI诊断性能，为circRNA生物标志物的检测提供了新方法，在AMI诊断中具有广阔的应用前景。

根据世界卫生组织的数据，每年约有1790万人死于心血管疾病（CVD），占全球死亡人数的31.8%。心血管疾病包括冠心病、脑血管疾病和风湿性心脏病等一系列影响心脏或血管的疾病。 在这些疾病中，急性心肌梗死（AMI）与高发病率和高心源性猝死风险有关，是冠心病最严重的表现。 如今，AMI的临床诊断主要依赖于心电图结合循环心肌肌钙蛋白的高敏感性评估。虽然心肌肌钙蛋白的高灵敏度检测提高了AMI诊断的及时性，但也降低了诊断特异性。 因此，相关学者正在不断探索可替代生物标志物的方法，以保证及时有效的医疗护理，这对于改善AMI患者的临床结果至关重要。

环状RNA（circRNA）通过反向剪接特定外显子，使其发生环化产生的，是一种新兴的非编码RNA生物标志物，可预测许多人类疾病的发生。 CircRNA具有共价闭环结构，分布在许多组织中，在各种细胞生物反应过程中具有活性，可作为miRNA海绵、RNA结合蛋白海绵或转录调节因子发挥作用。 近年来，科研人员发现circRNA的异常表达与AMI密切相关。有研究表明，circRNA_104761可作为miRNA-449和miRNA-34a的结合蛋白海绵参与AMI发展，其表达在AMI患者血液样本中明显下调。 该团队曾确定缺氧诱导的circRNAcZNF292是潜在的循环标志物，可以用来构建AMI诊断的预测模型。 上述发现明确了circRNA作为新的诊断生物标志物的价值，迫切需要检测circRNA的方法来为精确诊断AMI提供新选择。

图1 CRISPR-Cas系统协同检测循环RNA的示意图（摘自Small）

目前，逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）主要应用于circRNAs的检测。 该方法具有较高的灵敏度，使用发散引物靶向反剪接连接（BSJ）序列，可以消除同源线性RNA的干扰。然而，由于逆转录酶的链置换电位和引物的错误引发，RT-PCR中难免出现检测错误。 鉴于此，已经开发了许多依赖于特异性识别BSJ序列的新方法来检测circRNA，并实现了理想的灵敏度和特异性，但也面临一定挑战。 如一些方法利用了circRNA的环特性，通过滚动环扩增进行检测，但由于聚合酶的合成能力有限，仅适用于短序列circRNA。

一些方法利用核酸酶（如双链特异性核酸酶和T7核酸酶）来实现靶circRNA的环扩增，但需要RNaseR处理来消化同源线性RNA，很容易导致线性RNA未被消化或circRNA的非特异性消化，继而产生错误信号。一些方法在检测过程中引入了无酶DNA组装（如杂交链反应和催化发夹组装），不需要高精度的温度控制，但其灵敏度或耗时往往差强人意 。此外，据作者所知，很少有关于检测和分析心血管疾病相关循环RNA的研究，但迫切需要简便但灵敏的检测circRNAs的新方法来辅助AMI等疾病诊断。

图2 CRISPR-Cas系统分析用于AMI诊断的临床样本（摘自Small ）

过去十年中，CRISPR-Cas系统（最初是在原核生物中发现的适应性免疫系统）已经成为创建特定位点修饰的强大基因编辑工具。 基于Cas效应物（如Cas12和Cas13）的独特反式切割活性，CRISPR-Cas系统推动了检测与人类疾病相关的各种生物标志物的快速发展。 最近，研究发现CRISPR-Cas13可以在特定CRISPRRNA（crRNA）的指导下直接识别circRNA的BSJ序列，并将目标circRNA与其同源的线性RNA区分开来。

该研究利用circRNA靶向能力，通过引物交换反应（PER）将其与Cas效应子支持的级联反式切割整合，设计了一个协作的CRISPR-Cas系统，以开发一种用于circRNA检测的新电化学方法。作者以cZNF292为模型，验证了协作CRISPR-Cas系统定量测定靶circRNA的超高灵敏度，在临床血液样品中也显示出高特异性和实用性。因此，该方法为检测循环circRNA提供了一种新选择，无需复杂的预处理过程，具有为AMI患者的临床诊断和及时干预提供早期预警和精确指导的潜力。

参考消息：

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/smll.202402895

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