6+纯生信！单细胞分析揭示乳腺癌转移异质性

方法

结果

目的： 了解乳腺癌转移过程中不同细胞类型的变化。

结果：

1. 整合17个原发性肿瘤样本和37个淋巴结前转移样本的单细胞数据并确定了7种主要细胞类型（图1b，c）；

2. 雷达图显示，原发性肿瘤和淋巴结前转移在上皮细胞和巨噬细胞的比例上相似（图1d）；

3. 淋巴结前转移相比原发性肿瘤表现出T细胞的累积和成纤维细胞的耗竭（图1d）；

淋巴结前转移显示出比原发性肿瘤更高的细胞组成间的样本异质性。

目的： 识别转移性上皮细胞亚型并了解其在乳腺癌转移中的作用和特性。

结果：

1. 对上皮细胞进行重新聚类并用Scissor整合大量数据的转移表型，确定了4961个Scissor+cell，其中95.1%来自有淋巴结转移的患者，3484个Scissor-cell均匀分布在原发性肿瘤和淋巴结前转移中（图2a，b）；

2. 根据Scissor的结果，识别出8个上皮细胞亚型（图2c）；

3. Epi1-3亚型占转移性亚型的大多数，并且表达转移性标记基因，如PSMA7、CRIP1、S100A8和S100A9（图2d）；

4. GO分析显示，Epi1-3亚型特异性上调的基因富集在氧化磷酸化、质子动力势驱动的ATP合成和有氧呼吸等生物学过程中（图2e）。

目的： 探究转移性上皮细胞亚型在基因组水平上的异质性和细胞分化特征。

结果：

1. CNV分析显示，转移性Epi1-3亚型显示了高水平的拷贝数扩增，非转移性Epi7亚型显示高水平的拷贝数扩增，而Epi8亚型则显示高水平的拷贝数缺失（图3a）；

2. Epi1-3和Epi7-8亚型相比Epi4-6亚型有更高的CNV评分（图3b）；

3. 克隆性分析揭示了原发性肿瘤和前淋巴结转移之间不同的克隆进化模式（图3c）；

4. 拟时序分析显示，八种上皮细胞亚型存在三种不同的状态，其中Epi1-3亚型主要分布在状态1，而Epi7亚型主要在状态3（图3d，e）；

5. 状态3由于其低EMT得分和高CytoTRACE得分被认为是潜在的根状态（图3f，g）；

6. 在伪时序轨迹的末端，转移性Epi1-3亚型占据了具有高CytoTRACE得分的状态，表明转移过程中上皮细胞的分化是协调一致的（图3g）；

7. 通过BEAM分析，识别了37个分支依赖基因，这些基因可能调节从预分支到细胞命运2（状态1）和细胞命运1（状态2）的细胞分化过程（图3h）；

8. KCNK15和MUCL1的表达随着从前分支到细胞命运2的推断伪时序而升高（图3i，j）。

目的： 探究转移性上皮细胞亚型在乳腺癌转移中的调控机制以及转移潜力。

结果：

1. ASCL1在Epi1亚型中具有最高的RSS，而RARB和NR2F1分别在Epi2和Epi3亚型中特异性富集（图4a）；

2. Epi2和Epi3亚型共享了一些调节子，例如ZEB1和NR2C1（图4a）；

3. 基于SCENIC结果构建转录调控网络，并发现ASCL1是靶向Epi1亚型DEGs的关键转录因子(图4b)；

4. 在Epi3亚型中，NR2F1作为编码粘蛋白MUCL1的转录因子被突出显示；

5. 相关性分析显示，357个调节子被聚类为8个主要模块（图4c）；

6. 结合37个结前转移的25个成对转移淋巴结样本数据后发现来自转移淋巴结的上皮细胞与Epi1-3亚型密切相关（图4d，e）；

7. Epi1亚型在两个乳腺癌骨转移样本中的Epi得分显著高于Epi2-3亚型（图4f）；

8. 相反，Epi3亚型在一个乳腺癌脑转移样本中的Epi得分显著高于Epi1-2亚型（图4g）。

目的： 探究癌症转移与TME的关联。

结果：

1. T细胞进一步聚类分析显示17个细胞簇，包括naïve T细胞、NK细胞和CD4+/CD8+细胞（图5a，b）；

2. NK细胞和CD8+T细胞在结前转移中显著富集，而naïve T细胞在原发性肿瘤中富集（图5c）；

3. CD4+T细胞在结前转移中表现出效应标志物显著下调和衰竭标志物上调，NK和CD8+T细胞则表现出细胞毒性标志物显著下调（图5d）；

4. 成纤维细胞进一步聚类分析显示17个簇，可分为基质CAF（mCAF）、炎症CAF（iCAF）和血管CAF（vCAF）（图5e，f）；

5. 值得注意的是，vCAFs在结前转移中比例增加，表明其在乳腺癌转移中起着重要作用（图5g）。

目的： 探究vCAF在前淋巴结转移中的作用机制。

结果：

1. 利用CellChat分别构建原发性肿瘤和结前转移的细胞互作网络（图6a，b）

2. 在结前转移中，CXCL9+巨噬细胞与成纤维细胞和内皮细胞的相互作用增强，特别是与vCAF的相互作用（图6a-c）；

3. 结前转移中的CXCL9+巨噬细胞通过多种受体-配体对，如VEGFA-VEGFR1，VEGFAVEGFR2和CXCL8-ACKR1等，进一步调节内皮细胞，尤其是毛细血管内皮细胞（图6d）。

目的： 分析转移性上皮细胞亚型与不良临床特征之间的关联性，挖掘临床价值。

结果：

1. 在TCGA数据集中，富集分数高的组与较差的总体生存率（OS）显著相关（图7a）；

2. 在三个独立乳腺癌数据集中，高分组也显示出较差的总体生存率（图7b-d）；

3. 在乳腺癌常见突变基因（>5%）中，高分组的TP53突变频率显著高于低得分组，而CDH1突变频率则显著低于低分组（图7e，f）；

4. 在METABRIC数据集中，高分组还表现出不利的临床特征，如更高的PR阴性状态频率和更高的组织学分级（图7g）；

5. 在仅接受抗PD-1治疗的患者中，Epi2亚型的Epi评分最低，而Epi1和Epi3亚型的Epi评分相对较高（图7h）；

6. Epi1和Epi2亚型几乎不受免疫治疗的影响，而Epi3亚型在免疫治疗过程中下降了Epi评分（图7h）；

7. 在接受新辅助化疗后接受抗PD-1治疗的患者中，Epi2亚型的Epi评分最低，而Epi3亚型Epi评分下降（图7i）。