一种抗衰老水凝胶在减轻椎间盘退变和腰痛中的应用

氧化应激和衰老会导致髓核（ NP ）细胞的进行性衰老，从而导致椎间盘（ IVD ）退变（ IVDD ）。在某些情况下，退行性 IVD 可进一步引起腰痛（ LBP ）。一些研究证实，延缓和恢复 NP 细胞的衰老可以减弱 IVDD 。然而， IVD 相对封闭的组织结构对抗衰老药物的局部应用提出了挑战。

为此，中山大学郑召民教授团队与南方科技大学吴德成、刘洪梅教授团队通过苯硼酸修饰的甲基丙烯酰明胶（ GP ）与槲皮素结合开发了抗衰老水凝胶（ GPQ ），该水凝胶通过去除衰老的 NP 细胞达到缓解 IVDD 的效果。该水凝胶在病理条件下具有可注射性、生物降解性、良好的生物相容性，并能实现槲皮素的 pH 响应性释放。体外实验表明，水凝胶可降低衰老 NP 细胞中衰老标志物的表达，恢复代谢平衡。体内研究证实，单次原位注射水凝胶可以维持 IVD 组织结构，并减轻大鼠模型对有害力学刺激的敏感性，从而提出了一种改善 IVDD 和 LBP 的潜在治疗方法。

首先，研究人员通过三步化学反应将双键和 PBA 基团接枝到明胶分子链上制得 GP 材料，其对槲皮素具有良好的负载能力。 GPQ 水凝胶具有薄壁互连多孔结构、良好的吸水性，可光交联、可注射，并且能够在酸性微环境中响应性地释放治疗药物（图 1 ）。

紧接着，研究者评价了 GPQ 水凝胶对细胞衰老的影响。根据 SA-β-gal 染色及半定量分析、 mRNA 表达水平分析可知， GPQ 可明显降低细胞衰老基因（ p16 、 p21 ）和炎症基因（ IL-1 β、 IL-6 ）的表达。 qPCR 和免疫荧光实验证明 GPQ 可维持 ECM 合成。以上结果表明 GPQ 水凝胶能够减少衰老细胞的数量和炎症因子的表达，并能恢复细胞的代谢平衡（图 2 ）。

复制性衰老是细胞衰老的另一个常见原因，并且与年龄相关疾病密切相关，因此，研究者将第 2 代 NP 细胞作为 Young 组，使用第 6 代后的细胞作为 Aging 组，以评价 GPQ 水凝胶对复制细胞衰老的影响。 SA- β -gal 染色及半定量分析显示， GPQ 水凝胶显著降低衰老细胞中 SA- β -gal 的活性及衰老相关基因的表达，明显恢复 ECM 合成。 Aggrecan 免疫荧光染色和分解代谢相关基因的 qPCR 结果进一步证实上述结论。以上结果表明， GPQ 水凝胶可以减少复制性衰老细胞的数量，缓解代谢失衡，促进功能恢复（图 3 ）。

随后，研究人员建立了针刺大鼠椎间盘退变模型，并在 GPQ 组设置浓度梯度，以评估其治疗 IVDD 的疗效（图 4A ）。 X 光和 MRI 图像结果表明 GPQ 组的不同浓度对于疗效无显著差异，但明显优于其他组。 H&E 和 SF 染色显示， 4 周时，与其他组相比， GPQ 组显示出相对完全的 IVD 结构， NP 面积更大，组织形状更呈圆形， AF 与 NP 之间的边界更清晰。 8 周时， 10 μ M 和 2 μ M GPQ 组存在明显的 AF 缺损。免疫组化结果显示 50 μ M GPQ 组 p21 的表达量最低， Col II 的信号强度最强。综上，在大鼠 IVDD 模型中， GPQ 水凝胶有效延缓了 IVDD 的进展，但不同浓度 GPQ 组间的成像结果差异不明显，高浓度组在组织学水平上表现出明显优势（图 4-5 ）。

然后，研究者探索了高浓度 GPQ 水凝胶改善老年大鼠 IVDD 的有效性。 Micro-CT 结果显示， GPQ 和 GP 组的椎间盘高度均恢复，无显著差异。髓核含水量和 Piffrmann 评分显示 50 μ M GPQ 水凝胶能保持 IVD 的高度，较大程度上恢复 NP 的水化程度。 H&E 和 SF 染色显示， 50 μ M GPQ 组可保留相对完整的 NP 组织。组织学评分进一步证实了以上结果。因此， 50 μM GPQ 水凝胶可有效维持老年大鼠 IVDD 模型的组织结构，并改善 IVDD 的进展（图 6 ）。

最后，研究者对 GPQ 水凝胶能否缓解 IVDD 所致的 LBP 进行了探索。研究者在幼鼠中建立了腰椎前路穿刺的动物模型，以观察疼痛相关的行为学变化。 MRI 结果显示， GPQ 水凝胶可有效维持 NP 组织的水合程度。压力痛觉阈值（ PAT ）分析结果表明， GPQ 水凝胶对大鼠 LBP 有明显的缓解作用。 Von Frey 和 Hargreaves 试验测量了下肢的机械和热疼痛，结果显示三组之间无显著差异，可能是通过前穿刺， IVD 未向后压迫神经根。此外，在 IVDD 期间，神经末梢从外侧 AF 扩张至 NP 组织，并伴随神经营养因子（如 NGF ）水平升高，导致对疼痛的敏感性增加。免疫荧光图像及定量分析表明 GPQ 水凝胶处理后神经生长减少。所以， GPQ 水凝胶可有效降低大鼠退变腰椎 IVD 对力学刺激的敏感性（图 7 ）。

综上所述，该研究成功合成 PBA 修饰的明胶甲基丙烯酰酯，并利用 PBA 和槲皮素之间的动态硼酸酯键构建含有槲皮素的可注射水凝胶。 GPQ 水凝胶表现出槲皮素的 pH 响应性释放，可有效抑制氧化应激和复制性衰老条件下 NP 细胞中衰老标志物的表达，恢复代谢稳态。单次局部注射 GPQ 水凝胶后，可维持椎间盘高度和 NP 组织结构，并有效减轻 IVDD 模型对力学刺激下疼痛的敏感性，在治疗 IVDD 和其他衰老相关疾病中具有很好的应用前景。

该研究由 中山大学郑召民教授团队与南方科技大学吴德成、刘洪梅教授团队 完成，并于 2024 年 7 月 26 日在线发表于 Bioactive Materials 。

论文信息： Wantao Wang, Lei Liu, Wenzheng Ma, Lei Zhao, Lin Huang, Dan Zhou, Jinghao Fan, Jianru Wang, Hongmei Liu ^** , Decheng Wu ^*** , Zhaomin Zheng ^* . An anti-senescence hydrogel with pH-responsive drug release for mitigating intervertebral disc degeneration and low back pain. Bioactive Materials 2024, 41: 355-370.