点评 | 高福（中国科学院院士）、赵国屏（中国科学院院士）、饶燏（清华大学）病毒感染严重危害人类健康和社会经济发展。疫苗是预防和控制传染病最经济有效的手段之一。传统疫苗存在局限：或免疫效果差，难以预防病毒的变异；或安全性差；或研制技术复杂不通用、周期长、依赖于研究人员的经验。“下一代疫苗的开发”被Science杂志列为125个前沿科学问题之一（www.science.org/content/resource/125-questions-exploration-and-discovery）。在诸多种类疫苗中，减毒活疫苗因其在免疫效果方面具备潜在优势而成为重要发展方向之一，如流感减毒疫苗可采用更为简单、经济、无痛、且与自然感染途径一致的鼻内喷雾方式接种；可保留病毒全部或绝大部分抗原的天然结构，可诱导更广的免疫应答，包括体液免疫、呼吸道黏膜免疫、细胞免疫等；可提供交叉免疫保护作用。然而，长久以来，安全性差始终限制着减毒活疫苗的快速发展与应用。为了提高减毒活疫苗的安全性，领域内研究人员从不同的技术路线进行了不懈努力，近年来新型减毒技术不断涌现，并逐渐向着以合成生物学为代表的更加理性设计的方向发展。2025年1月15日，中国科学院深圳先进技术研究院合成生物学研究所、定量合成生物学全国重点实验室司龙龙研究员团队，在Nature Chemical Biology发表了题为 PROTAR Vaccine 2.0 generates influenza vaccines by degrading multiple viral proteins 的研究论文（PROTAR为Proteolysis-Targeting的英文简称）。该工作以流感病毒为研究对象，在该团队于2022年提出的第一代PROTAR疫苗技术（Nature Biotechnology 40, 1370–1377 (2022)）的基础上，进行了优化升级，拓展了技术灵活性和通用性，建立了第二代PROTAR疫苗技术（PROTAR疫苗2.0）。PROTAR疫苗2.0利用宿主细胞的泛素-蛋白酶体系统，通过操控病毒多个蛋白的稳定与降解，将野生病毒减毒成为活疫苗。该工作为减毒活疫苗研制提供了新思路、新方法。
在本研究中，司龙龙团队利用宿主细胞的泛素-蛋白酶体系统可选择性降解靶蛋白的生物学机制，设计“生命开关”元件，工程病毒基因组，使得相应的病毒蛋白在正常细胞中会被泛素-蛋白酶体系统识别而降解，导致病毒复制能力减弱，将野生病毒转化成为蛋白降解靶向（Proteolysis-targeting, PROTAR）的潜在疫苗；为了实现PROTAR疫苗的高效制备，研究团队构建了泛素-蛋白酶体系统功能缺陷的工程细胞系，在该细胞系中“生命开关”元件介导病毒蛋白降解的功能失效，病毒蛋白稳定，使得PROTAR疫苗可以高效复制而大量制备（图1）。研究团队将这一技术命名为第二代PROTAR疫苗技术（PROTAR疫苗2.0）。与该团队2022年提出的第一代PROTAR疫苗技术（Nature Biotechnology 40, 1370–1377 (2022)）仅允许“生命开关”元件装载在病毒蛋白两端（N端和C端）相比，PROTAR疫苗2.0支持“生命开关”元件装载在病毒蛋白的任意合适的位点，包括病毒蛋白两端和内部位点。这一技术改进，不仅为“生命开关”元件在病毒蛋白中的装载提供了大量位点选择空间，提高了技术灵活性和通用性；而且可以实现多个“生命开关”元件在同一病毒颗粒中的同时装载，提升了疫苗的安全性。
图1. PROTAR疫苗2. 0工作原理。VP，病毒蛋白(viral protein)；Ub，泛素（ubiquitin）；PTD，蛋白降解靶向元件。
具体地，该团队将能被VHL E3泛素连接酶识别的蛋白降解靶向元件PTD1和能被β-TrCP E3泛素连接酶识别的蛋白降解靶向元件PTD2，分别引入至流感病毒8种不同蛋白的不同位点，构建了多个含有PTD1或者PTD2的PROTAR 2.0病毒株。研究结果证明，被PTD1或者PTD2标记的病毒蛋白会被宿主细胞中的泛素-蛋白酶体系统识别而降解，从而实现PROTAR 2.0病毒减毒。为了提高安全性，该团队将PTD1和PTD2进行组合，装载至一个病毒颗粒中，构建了装载双PTD的组合毒株，包括装载两个PTD1组合的毒株PROTARVHL/VHL、装载两个PTD2组合的毒株PROTARβ-TrCP/β-TrCP、装载一个PTD1和一个PTD2组合的毒株PROTARVHL/β-TrCP。结果表明，与装载单个PTD的毒株相比，这些组合毒株的安全性显著提高。该团队在动物模型中，对PROTAR 2.0疫苗候选株进行了安全性评价。与野生型（WT）流感病毒相比，相同剂量的PROTAR 2.0疫苗候选株（PROTARVHL/VHL、PROTARβ-TrCP/β-TrCP、PROTARVHL/β-TrCP）均未引起小鼠死亡、体重减轻或任何其他疾病症状，说明了PROTAR 2.0毒株在小鼠模型中的安全性。该团队对PROTAR 2.0疫苗在小鼠体内引发的免疫反应进行了评价。结果表明，PROTAR 2.0疫苗能够诱导强而广的免疫应答，包括体液免疫、肺黏膜免疫、细胞免疫应答。PROTAR 2.0疫苗候选株可提供交叉免疫保护，有效预防同源病毒WSN和异源病毒H3N2的感染。PROTAR 2.0疫苗的免疫保护功效，在雪貂模型中得到了验证。此外，本工作证明了PROTAR 2.0疫苗技术具有通用性，不仅适用于甲型流感病毒的WSN毒株、PR8毒株，还适用于乙型流感病毒。与基于甲型流感病毒的PROTAR 2.0疫苗的研究结果一致，基于乙型流感病毒的 PROTAR 2.0疫苗候选株也可以诱导强而广的体液免疫应答、肺黏膜免疫应答、T细胞免疫应答，并对野生型B型流感病毒感染提供高效预防效果。中国科学院深圳先进技术研究院合成生物学研究所司龙龙研究员为文章的通讯作者，团队成员张春贺（博士）、侯积环（博士后）、李桢（博士）、申权（博士）、陈丽（2021-2022年研究助理）、沈金影（研究助理）、王平（博士）为文章共同第一作者；深圳耀速科技有限公司白海清博士同为文章共同第一作者。同期，该团队在Nature Microbiology上发表了题为“Proteolysis-targeting influenza vaccine strains induce broad-spectrum immunity and in vivo protection”的研究成果。该团队以流感病毒为模型，在其于2022年提出的第一代PROTAR疫苗技术（Nature Biotechnology 40, 1370–1377 (2022)）的基础上，利用宿主细胞泛素-蛋白酶体系统中E3泛素连接酶的多样性，构建了多种蛋白降解靶向（Proteolysis-Targeting, PROTAR）减毒活疫苗，拓展了PROTAR流感减毒活疫苗的多样性；并在细胞、动物、人类器官芯片模型中，系统阐释了多种PROTAR疫苗株的安全性、免疫效果、免疫特征。该工作不仅展示了PROTAR疫苗的多样性，而且对获得具有临床转化价值的、优化的PROTAR疫苗候选株具有重要意义。
该团队以流感病毒为模型，利用E3泛素连接酶的多样性，设计构建了22类PROTAR疫苗株。实验结果显示，这些PROTAR疫苗株具有不同的制备效率和减毒水平。进一步，该团队使用多种实验技术（蛋白酶体抑制实验、PTD关键氨基酸突变实验、PTD氨基酸乱序实验、免疫共沉淀实验、泛素化检测实验、E3泛素连接酶敲低实验、E3泛素连接酶抑制实验），对22类PROTAR疫苗株进行减毒机制探索，确证了其依赖于E3泛素连接酶-蛋白酶体的减毒机制。该团队选择其中的6株PROTAR疫苗株作为代表，进行了动物模型中的安全性评价。当使用105 TCID50剂量的野生型病毒感染C57BL/6J小鼠后，小鼠体重显著下降，并在感染后的9天内死亡；而接种相同剂量的PROTAR疫苗株的小鼠未出现任何体重下降或其他疾病症状。此外，野生型病毒感染三天后，在小鼠肺组织中可以检测到高滴度的病毒，而接种相同剂量的PROTAR疫苗株的小鼠肺组织中的病毒滴度在检测限以下。这些结果说明，PROTAR疫苗株在小鼠体内复制能力显著下降，具有良好的安全性。该团队对PROTAR疫苗在小鼠体内诱导的免疫应答进行了系统评价。结果表明，PROTAR 疫苗在小鼠体内能够诱导强而广的免疫应答，包括体液免疫、肺黏膜免疫、细胞免疫应答。针对B细胞应答的深度分析表明，PROTAR疫苗可以诱导流感特异性B细胞反应，包括生发中心B细胞、记忆B细胞、血浆B细胞反应。此外，研究结果显示，不同PROTAR疫苗株诱导的免疫应答强度、免疫细胞分化发育存在差异，说明PROTAR疫苗株的免疫原性与E3泛素连接酶、PTD的种类存在一定程度的相关性。该团队进一步在动物（小鼠、雪貂）模型中评价PROTAR疫苗株的免疫保护效果。结果表明，PROTAR疫苗候选株可提供交叉免疫保护，有效预防同源病毒和异源病毒的感染。鉴于老年人是流感感染的高风险群体，该团队评价了PROTAR疫苗在老龄鼠中的免疫效果。结果显示，PROTAR疫苗在老龄鼠中同样诱导了广泛而有效的免疫应答，并且对野生病毒感染具有高效保护作用。由于有报道称预存免疫会影响疫苗的免疫效果，该团队建立了预存免疫小鼠模型，并评价了PROTAR疫苗在含有预存免疫的小鼠中的免疫效果。结果显示，PROTAR疫苗在含有预存免疫的小鼠中，依旧可以诱导强而广的的免疫应答，并且对野生病毒感染具有高效保护作用。进一步，该团队在人肺气管类器官芯片上，评价了PROTAR疫苗的安全性。结果显示，野生型（WT）病毒和PROTAR疫苗分别感染人肺气管类器官芯片48小时后，野生型（WT）病毒在人肺气管组织中具有较高的滴度，而PROTAR疫苗的滴度在检测限以下；免疫荧光实验也显示，与野生型（WT）病毒相比，PROTAR疫苗在人肺气管组织中的复制显著减弱。此外，与野生型（WT）病毒相比，PROTAR疫苗接种，诱导了更低水平的免疫细胞反应及细胞因子表达。这些结果说明，PROTAR疫苗在人肺气管类器官芯片中具有良好的安全性。综上，该研究工作利用E3泛素连接酶的多样性，通过大量设计构建PROTAR疫苗株，拓展并展示了PROTAR疫苗的多样性；系统研究了PROTAR疫苗的安全性、免疫原性、免疫保护效果；为开发更优的、具有临床转化潜力的PROTAR疫苗候选株奠定基础，有望促进PROTAR疫苗技术的推广应用和临床转化。
中国科学院深圳先进技术研究院合成生物学研究所司龙龙研究员为文章的通讯作者，团队成员沈金影（研究助理）、李静（助理研究员）、申权（博士）、侯积环（博士后）、张春贺（博士）为文章共同第一作者；深圳耀速科技有限公司白海清博士、北京大学艾晓妮副教授同为文章共同第一作者。
司龙龙，中国科学院深圳先进技术研究院研究员、博士生导师，定量合成生物学全国重点实验室副主任，国家级青年人才，国家重点研发计划首席科学家。目前实验室主要研究方向为“病毒感染及防治研究的新策略和新系统的开发及应用”，包括基于合成生物学的疫苗研制、人类器官芯片开发与应用等。代表性成果以通讯作者、第一作者（含共同一作）发表于Science、Nature Biotechnology、Nature Microbiology、Nature Biomedical Engineering、Nature Chemical Biology、Science Advances、Nature Communications等专业期刊。详见实验室网站：https://isynbio.siat.ac.cn/SILAB/list.php?pid=2本课题组长期招收分子生物学、细胞生物学、生物化学、药学、病毒、疫苗、免疫等研究背景的博士后、助理研究员。有意申请者请将个人简历（要求为PDF）进行投递，简历及应聘理由注明“应聘岗位-学校名称-专业-姓名”。https://jinshuju.net/f/ZqXwZt或扫描二维码投递简历
高福（中国科学院院士、美国国家科学院和医学科学院外籍院士）1918流感大流行一百多年后的今天，流感依然是世界最大的公共卫生挑战之一。根据世界卫生组织报道，每年全球约有10亿例病例，其中300万至500万例为重症病例，导致29万至65万例流感相关呼吸道疾病死亡。接种疫苗是预防流感病毒感染最经济有效的手段之一。相较于其他种类疫苗，减毒活疫苗在免疫强度、广度方面具有优势，但安全性较差始终困扰着减毒活疫苗的研发及转化应用。因此，开发更加安全、高效的减毒技术是减毒活疫苗研究领域的关键共性科学问题。司龙龙团队提出并建立了第一代“蛋白降解靶向（PROTAR）减毒活疫苗技术”新概念（Nature Biotechnology 40, 1370–1377 (2022))，利用细胞中E3泛素连接酶VHL操控流感病毒蛋白的降解，将野生型流感病毒转化成减毒活疫苗。在当前发表在Nature Microbiology期刊上的这项研究工作中，该团队基于第一代PROTAR减毒活疫苗技术，进一步挖掘利用细胞中E3泛素连接酶的多样性，大规模设计构建了依赖不同E3泛素连接酶降解的PROTAR流感减毒活疫苗株，建立了PROTAR流感减毒活疫苗库，系统研究了不同疫苗株的安全性、免疫原性、免疫保护效果。该工作极大丰富了PROTAR流感减毒活疫苗的多样性，支撑PROTAR活疫苗系统评价与优化，拓展了人们对PROTAR减毒活疫苗的认知，为 PROTAR疫苗技术的推广应用提供科学基础。同期，该团队在Nature Chemical Biology期刊发表研究成果，报道了第二代PROTAR疫苗技术（PROTAR疫苗2.0），与第一代PROTAR疫苗技术相比，PROTAR疫苗2.0版本打破了蛋白降解诱导元件设计位点单一的局限，可以在病毒多个蛋白多个位点上引入蛋白降解诱导元件，进一步提升疫苗安全性和技术的灵活通用性。该团队在PROTAR减毒活疫苗研发方向上的连续性工作为包括流感在内的多种流行性病毒的减毒活疫苗设计提供了新思路、新方法。合成生物学作为一门新兴的交叉学科，借鉴工程学原理，设计改造天然生物系统，或合成新的生物体系，揭示生命运行规律（造物致知），变革生物体系工程化应用（造物致用），在食品、医药、能源、环境、材料、农业等领域发挥着越来越重要的作用。司龙龙团队运用合成生物学原理技术，以流感病毒为模型，在病毒蛋白上设计装载介导蛋白降解的E3泛素连接酶专一识别肽段，这样一种“生命开关元件”；此类被改造的病毒，虽然可以在能够将生命开关元件从病毒蛋白上移除或者E3失活的细胞中复制繁殖，但进入正常的宿主细胞后，植入“生命开关”的突变蛋白就会被E3靶向降解，进而控制病毒复制，成为减毒活疫苗。该团队将这一技术命名为蛋白降解靶向（PROTAR）疫苗技术，该疫苗技术最初由该团队于2022年提出（Nature Biotechnology 40, 1370–1377 (2022)）。过去几年，该团队从“生命开关元件种类多样性”和“元件装载位点的多样性”两个维度，对PROTAR疫苗技术进行了优化迭代，相关成果同期分别发表在Nature Microbiology和Nature Chemical Biology期刊。在Nature Microbiology期刊成果中，该团队利用细胞内E3泛素连接酶的多样性，系统地设计和构建可以操控病毒蛋白靶向降解的生命开关元件，进而构建具有不同水平安全性和免疫原性的PROTAR疫苗株；通过系统地筛选和评价，可以获得安全可控和高效免疫兼备的PROTAR疫苗株。在Nature Chemical Biology期刊成果中，该团队拓展了元件装载位点的多样性，从原来只能在流感病毒单个蛋白（M1）的C端引入生命开关元件，拓展到可以在病毒多个蛋白的多个位点上引入多个不同的生命开关元件，这一优化使得同一疫苗株可以包含多个生命开关元件的组合，进一步提高安全性。值得一提的是，不同个体/群体之间E3泛素连接酶的表达丰度和功能强度有可能存在差异，该团队建立的依赖不同种类E3泛素连接酶减毒的PROTAR流感疫苗库, 可以为不同个体/群体提供适合的PROTAR疫苗株，为流感疫苗在不同个体/群体中的个性化接种提供可行性。该工作基于合成生物学研发新型疫苗技术，丰富了人们对抗传染性疾病的武器库，是合成生物学推动生物医药发展的成功范例。泛素-蛋白酶体系统是细胞内天然存在的一种蛋白质降解机器，作为细胞内蛋白质降解的主要途径，参与细胞内80%以上蛋白质的降解，以维持细胞内蛋白质稳态。近年来，科研人员利用泛素-蛋白酶体系统可以降解蛋白的生物学功能，开发基于化学小分子的蛋白降解剂，用于治疗肿瘤等疾病，正逐渐成为新药研发领域的重要前沿。司龙龙团队开发的基于蛋白降解的PROTAR活疫苗技术，是泛素-蛋白酶体系统生物学机制在除化学小分子药物开发之外的又一创新应用和重要拓展，也为新型疫苗开发提供了全新策略。该团队开发的PROTAR疫苗技术提供了一个简单易行的疫苗制备方法，通过基因工程手段，在病毒蛋白的合适位点引入可以被泛素-蛋白酶体系统识别的氨基酸序列（文中简称PTD），条件性“开”和“关”病毒蛋白降解，可以分别实现PROTAR疫苗减毒和制备；进一步优化PTD的序列和在蛋白中的位置，或者增加PTD的数量和种类，可以进一步增加PROTAR疫苗的安全性。此外，PROTAR疫苗方法在将病毒减毒、增加安全性的同时，还可以利用细胞中泛素-蛋白酶体系统的抗原递呈能力，增加疫苗抗原表位肽的递呈，从而在降低病毒复制、增加安全性的同时，可以保留甚至增强疫苗的免疫效果。该方法通过主动诱导和增加病毒抗原递呈，有助于新的病毒抗原肽的产生和发掘，拓宽人们对病毒的免疫学认知，促进相应的病毒防治策略的开发。PROTAR疫苗技术的另一重要特色是，它可以充分利用泛素-蛋白酶体系统中E3泛素连接酶的多样性、病毒蛋白种类和氨基酸位点的多样性，系统性地制备具有不同安全性和免疫原性的PROTAR病毒株，为最优PROTAR疫苗株的鉴定提供了可能。原文链接：
https://www.nature.com/articles/s41589-024-01813-z
https://www.nature.com/articles/s41564-024-01908-2
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