ACS Nano | 催化杂化脂质纳米粒子促进基于环状RNA的细胞因子免疫疗法

大家好，今天与大家分享一篇近期发表 ACS Nano 上的文章，题目为 Catalytic Hybrid Lipid Nanoparticles Potentiate Circle RNA-Based Cytokine Immunotherapy 。 文章的通讯作者是 清华大学的喻国灿教授，山西高等创新研究院刘志达研究员、浙江大学的毛峥伟教授以及马列教授。

细胞因子疗法在癌症治疗中受到半衰期短、毒性强和施用频繁的限制，而递送表达细胞因子的 RNA 可以解决此问题。然而， RNA 的胞内转染会产生过量活性氧物种（ ROS ）并过量消耗三磷酸腺苷（ ATP ），仅依靠传统的脂质纳米粒子（ LNPs ）递送系统无法解决此问题。因而，开发能够减少 ROS 产生并提高细胞内 ATP 水平的新型载体十分重要。

图 1 . Mn-LNPs 示意图

金属催化剂已被广泛应用于肿瘤的治疗。锰离子不仅具有良好的催化氧气产生的活性，而且能够清除 ROS ，因而在重塑肿瘤微环境中有着多重作用，将其制成四氧化三锰纳米粒子则更有利于跨越递送障碍，在酸性条件下释放锰离子。因此，如图 1 所示，本文作者希望开发一种 Mn 和 RNA 的共递送系统 Mn-LNPs ，将四氧化三锰纳米粒子与传统 LNPs 共组装，实现对编码 IL-12 的环状 RNA 的包载，从而在表达细胞因子的同时清除过量 ROS 并提升 ATP 水平，实现更好的肿瘤治疗。

图 2. Mn-LNPs 的制备与表征

如图 2 所示，作者利用乙酸锰通过水热法制备了以油酸和油胺为配体的四氧化三锰纳米粒子。 TEM 证实了纳米粒子的尺寸和形貌，能量色散 X 射线光谱分析证实了其中 O 和 Mn 元素的存在。 X 射线光电子能谱证实了其中二价锰离子和四价锰离子以 2 ： 1 的比例存在。 X 射线粉末衍射与四氧化三锰的标准谱一致，进一步证实了四氧化三锰纳米粒子的成功合成。由于此方法得到的二氧化锰在乙醇中溶解性较差，难以与 LNP 杂化，因而作者使用不同比例的 mPEG ₃ -COOH 进行配体交换并通过与脂质快速混合制备 LNP 。通过 DLS 测量不同 mPEG ₃ -COOH 比例的 Mn-LNPs 的水合动力学半径，结果显示当比例过低时，纳米粒子发生聚集，当比例过高时，纳米粒子表面疏水性不足难以与 LNP 共组装，因而选择 40% 为配体比例。 TEM 形貌图证实了四氧化三锰与 LNP 的共组装，且四氧化三锰在 LNP 中均匀掺杂。作者通过用 Mn-LNPs 负载表达 EGFP 的 RNA （ Mn-LNPs@RNA ^EGFP ）验证其转染效率，当其中四氧化三锰的质量分数为 5% 时具有最好的转染效率，显著高于不含锰的 LNP 。

图 3 . Mn-LNPs 的 ROS 清除效果

如图 3 所示 ，作者通过测定过氧化氢溶液中的溶解氧气含量来表征 Mn-LNPs 的催化能力。在酸性条件下， Mn-LNPs 使得氧含量显著增加，而中性条件下则无此效果，可能由于中性条件下 LNP 保持稳定阻碍了四氧化三锰与过氧化氢的作用。利用乏氧荧光染料染色，作者还证实了 Mn-LNPs 能够通过催化产生氧气改善肿瘤细胞乏氧。作者进一步表征了乏氧肿瘤细胞中氧气浓度对于转染效率的影响， 通过 孵育 Mn- LNPs@RNA ^EGFP 和不含锰的 LNPs@RNA ^EGFP ，作者发现 Mn-LNPs 为载体时的 EGFP 表达量显著更高。这可能是由于四氧化三锰的催化作用促进了 ATP 的产生。此外，作者还证实了 Mn-LNPs 抗氧化和清除羟基自由基的能力。作者还表征了 Mn-LNPs 的酸响应性，在酸性条件下孵育，可以观察到 Mn-LNPs 的解散，荧光成像还证实了这种酸响应性有利于 Mn-LNPs 的溶酶体逃逸。

图 4 . Mn-LNPs 的 ATP 促进能力

作者认为，四氧化三锰催化产生的氧气可以被线粒体利用从而增加 RNA 的转染。如图 4 所示，作者利用生物透射电子显微镜观察了线粒体超微结构的变化。 Mn-LNPs 孵育的肿瘤细胞其线粒体的数量和其中脊的数目与长度都有增加，证实了更好的代谢活性。此外，还观察到 Mn-LNPs 处理的肿瘤其 ATP 含量显著提高。为进一步揭示其中机制，作者对肿瘤细胞进行了 RNA 测序分析，热图和火山图显示， LNPs 孵育的组和 Mn-LNPs 孵育的组的基因表达存在显著差异，在 Mn-LNPs 中与氧气水平、 ATP 合成和线粒体代谢相关的基因显著上调，在低氧诱导因子 1 （ HIF-1 ）信号通路和氨基酸生物合成信号通路中尤为显著。

图 5 . Mn-LNPs 的体内 RNA 转染效果

如图 5 所示 , 作者对小鼠瘤内注射乏氧探针和不同 LNPs 进行荧光成像，在 Mn-LNPs 组中观察到荧光信号的下降。接着，作者用 Mn-LNPs 递送编码 IL-12 的环状 RNA ，通过检测外围血和肿瘤组织中的 IL-12 浓度，作者证实 Mn-LNPs@RNA ^IL-12 和 LNPs@RNA ^IL-12 都能带来 IL-12 表达量的持久提高，且 Mn-LNPs@RNA ^IL-12 在肿瘤中的表达量更高。作者对其治疗效果进行评估， Mn-LNPs@RNA ^IL-12 具有最好的肿瘤抑制效果。作者还评估了治疗过程中的免疫响应，流式细胞术显示 Mn-LNPs@RNA ^IL-12 组中肿瘤浸润的 CD8 ⁺ T 细胞显著增加，多种细胞因子含量上升，证实了其免疫治疗效果。

图 6 . Mn-LNPs 与 ICB 结合

如图 6 所示，作者尝试将 IL-12 的递送与注射抗 PD-L1 抗体的免疫检查点抑制（ ICB ）疗法相结合，两者的共同施用具有更好的肿瘤抑制效果，有效提高小鼠生存率。流式细胞术显示两者的共施用带来了最多的 CD8 ⁺ T 细胞浸润和最低的调节 T 细胞比例，且 CD8 ⁺ T 细胞中 的 Ki67 ⁺ 的表达增加，证实了其良好的增殖能力。免疫荧光成像和促炎细胞因子的增加也证实了两者共同施用所带来的免疫治疗效果。

综上所述，本文开发了一种四氧化三锰与传统 LNP 结合的 RNA 递送体系，利用四氧化三锰催化过氧化氢生成氧气的能力改善了 RNA 转染过程中的 ROS 增加和 ATP 过度消耗，用此系统递送表达细胞因子 IL-12 的 RNA 可以提升肿瘤治疗效果。

作者 ： ZHR 审校 ： ZXY

DOI: 10.1021/acsnano.4c14517

Link : https://doi.org/10.1021/acsnano.4c14517

上一篇