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文章来源：北京市药品检验所 周立春
1 仿制药有关物质的来源及研究重点
仿制药有关物质应主要源自以下几个方面：
① API 的合成过程, 可能带来相应的工艺杂质；
② API 与辅料的相容性；
③ API 的降解特性，包括在制剂工艺中的降解和自然放置过程中的降解。
而以上3 个方面来源的核心是API 的结构特性，因此，对API 的结构特性进行深入研究，是认识和解决有关物质问题的关键。
对API 结构特性的研究，应该关注以下几个方面：
①针对API 结构中的特点进行分析，包括其骨架结构的特点、共轭体系的特点、结构中重要官能团的特点以及合成工艺中可能带入的起始原料、中间体、反应副产物等；②应对已有文献中有关物质的控制方法以及文献中所提供的已知杂质进行分析和解读，特别是已知杂质的来源归属；③对实际试验数据进行评估，根据实际样品杂质谱的评估，对上述分析和预判进行梳理，建立杂质谱的逻辑关系，对杂质的来源有一个清晰的认识，从而可对杂质进行有效控制。
2 仿制药有关物质的文献分析方法评估
对这些现有文献分析方法进行评估，对仿制药有关物质一致性评价研究和药品风险的掌控极具借鉴意义。在评估过程中，应注意解读文献中的重要提示，而不是简单地将文献罗列出来。在文献的解读过程中，应该注意以下几个方面。
2.1 有关物质结构及理化特性的分析与文献分析方法中分离系统的相关性
有关物质与API 是否存在极性差异，可以从文献分析方法的如下特征加以判断：1）分离模式是否特殊，其中包括分离色谱系统是否特殊，如使用离子柱或氰基柱等，且各种文献中分离系统是否存在差异。2）色谱柱是否有特殊性要求，如对品牌是否有规定、对色谱柱的封端（spherical base-deactivated end-capped）是否有特殊要求等。3）流动相是否含离子对（阳离子系统或阴离子系统）试剂。4）分离度试验的提示，分离度试验的方式：①杂质对照品法，提示与哪些杂质的分离至关重要，要求一组分离度或两组分离度；②系列对照品法，提示系统的复杂性，并非一组分离度可以明确；③降解破坏法，提示降解途径等等。5）是否采用多种液相方法进行测定，提示单一色谱系统不足以解决问题。
以上这些分离方法的特征都在提示，有关物质的分离是否存在特殊性，而且这些特殊性针对了API 结构及理化特性中的哪些薄弱环节或关键点。
2.2 有关物质的结构特点确定文献分析方法的检测系统是
否具有针对性当采用紫外检测器进行分析时，有关物质结构的共轭体系与API 结构是否有差异非常重要，当差异较大时，API 与有关物质的紫外响应值会产生差异造成有关物质的计算误差。而文献检测方法的以下特征可提示有关物质在结构上与API 可能存在差异：1）检测方法是否特殊，是否采用了非常规检测手段，如荧光检测、电化学检测等，这种情况通常意味着紫外检测器有局限性，不能完成检测目的。2）检测波长的针对性，是否有多波长检测或检测波长切换现象，这种情况通常意味着API 与杂质的紫外吸收有差异，采用单一波长检测会造成误差。3）有关物质的计算方法是否采用外标法或校正因子法，通常如果API 与有关物质的紫外吸收相近，采用自身对照法是最简便易行的方法，但若采用外标法或校正因子法，则意味着API与有关物质的紫外吸收有差异，不能采用自身对照法。4）除了液相色谱法以外，是否采用了其他方法对有关物质进行监控，如薄层色谱法或颜色控制方法等，这同样说明液相方法有局限性。
2.3 分析方法的系统适用性试验特点
系统适用性试验对分离度的要求，提示分离系统的关键点；对峰谷比的要求，提示系统完全分离是有困难的；对拖尾因子的要求，提示色谱峰尾部会有杂质峰，应注意；对连续进样精密度的要求，提示系统中最容易出现问题的色谱峰，也是系统平衡的最低条件。以上这些信息在分析方法的可操作性上都有着重要的提示作用。
2.4 已知杂质的归属
从相关的文献资料中，可以了解到对原研产品或被仿制药已认知的安全性要求，即对已知杂质、未知杂质及杂质总量的限度要求。从欧洲药典或美国药典中，即可了解到许多关于已知杂质的信息，包括化学名和结构式，并通过对其的分析和解读，推测被仿制产品可能的合成工艺路线、可能产生的工艺杂质以及降解杂质，直至了解到已知杂质的归属。而通过对杂质限度的解读，则能对这些杂质的安全性和工艺允许达到的水平有所了解，这些信息对了解被仿制产品的杂质归属及安全水平有重要意义。
2.5 分析方法的修正与完善
在对文献分析方法评估的基础上，确定测定方法是否已经完善以及尚存在的问题，针对问题进行修改。同时，可通过强制破坏试验，从多角度探知API 的降解途径，确认所建立的色谱条件的有效性以及方法是否能真实反映产品的稳定性。而且，在强制破坏试验之后，应注意是否有新的杂质出现，特别应该关注新增杂质是否与加速试验和长期稳定性试验中出现的杂质相重合，如果有，应关注其实际含量，并根据其含量是否超过鉴定限，确认有无必要进行杂质的定性和后续的安全性研究。修改后的分析方法通过方法学验证，确认其有效性和可操作性，为后续的杂质谱分析奠定基础。分析方法的验证应参照相关的技术指导原则进行，重点关注专属性和灵敏度的验证。
3 仿制药与被仿制药实际样品的杂质谱分析
在仿制药有关物质一致性评价中，通过上述文献方法评估，采用相对完善的分析方法进行测定，完成以下杂质谱的比较：
①仿制药与被仿制药实际样品的杂质谱；
②仿制药与被仿制药的稳定性影响因素试验的杂质谱；
③仿制药工艺变更前后的杂质谱；
④仿制药既往加速试验与长期稳定性试验末期产品（甚至是过期产品）的杂质谱；
⑤原料药与制剂的杂质谱。
而通过这些杂质谱的比较，可以得到以下认知：①仿制药是否存在被仿制药所没有的超过鉴定限的未知杂质，如有发现，应分析来源：原料带入或辅料引起；②仿制药与被仿制药的稳定性影响因素是否呈现同样的规律，若不相同，应对造成的原因进行分析：处方原因或与关键工艺参数相关；③仿制药工艺变更后是否带入新的杂质，以确定新工艺所存在的问题；④仿制药真实存在的主要降解杂质，以确认降解途径；⑤原料的杂质对制剂的影响，以确定源头的控制，明确对原料的要求，而新制剂产生的杂质，应确认，哪些是与辅料有关的，哪些是工艺所致降解造成的，从而明确对辅料质量的要求以及对关键工艺参数的要求。对于与原研产品对比而证实的新增杂质及超鉴定限杂质，应进行杂质同质性考证，采用二极管阵列检测器（DAD）、液质联用（LC-MS）、不同流动相的相对保留时间（RRT）比较以及杂质对照品加入法等手段，与原研品进行所有杂质种类、含量及分布的比较和分析，以确定各种原因导致新增杂质的来源、安全性和可接受限度。若现有技术无法鉴定新增杂质和超量杂质，应提供相关结构信息（如母体化合物、某侧链等等），表明其归属，并将其作为特定的未知杂质，使用适当的分析标识（如：相对保留时间的标识），进行识别和控制。
4 杂质限度的确定
质量研究中确立了有关物质的具可操作性的有效检测方法，同时应确定有关物质的限度范围，使制剂的安全性与质量具备可控性。
4.1 已知杂质（特定杂质）的限度
通常人用药品注册技术要求国际协调会(ICH) 成员国药典同品种标准中控制的结构已知及结构未知（如仅以RRT 认定）的特定杂质，其安全性已经通过相关审核，因此其限度应参照相应标准中的要求进行控制。
4.2 超过鉴定限的未知杂质的限度
若出现与原研药不同的杂质，且其含量超过鉴定限时，应分析、评估杂质的来源，并对其进行定性分析，在结合工艺等信息而排除其为遗传毒性杂质或其他高
毒性杂质的情况下，按照《杂质研究技术指导原则》的要求，进行安全性求证或鉴定限度控制，且采用RRT 或其他方式指认，作为特定杂质进行控制，同时，根据安全性和稳定性数据，结合生产工艺，综合评估和确定杂质限度的科学性与合理性。而遗传毒性杂质信息数据库有待进一步积累，除了目前少数已知结构的遗传毒性杂质如烷化剂、黄曲霉等之外，其他遗传毒性杂质的限度控制应参考欧洲药品管理局（EMA）、ICH 等相关技术指导原则的基本思路，一般限度不超过1.5 μg.d-1 或1 ppm（1 ppm=0.000 1%）。
4.3 未超过鉴定限的未知杂质的限度
对于与原研药中相同或不相同的非特定杂质，需按标准中任一单个杂质的限度进行控制。
4.4 总杂质的限度
总杂质的限度需参考标准的要求进行控制，但应注意杂质总量的限度，不是单纯每个已知杂质和未知杂质的加和，而应该综合考虑；另外杂质总量的计算，要注意校正因子法中的峰面积应校正后进行加和或计算。
