Nat Commun | 中国科学院向华/龚路遥开发了最小I型CRISPR-Cas系统，用于人类细胞的转录激活和碱基编辑

CRISPR-Cas系统是广泛存在于原核生物中的适应性免疫系统。 它们可以分为两类，六种类型和30多个亚型。第一类包括I、III和IV型，由多种蛋白质组成的效应模块。第2类包括II型、V型和VI型，其特征是一个单一的多结构域效应蛋白。 CRISPR免疫机制通常涉及三个过程：适应，crRNA生物发生和干扰。

I型系统是最普遍的CRISPR-Cas类型，分为I-A到I-G七个亚型。 I型的crRNA结合复合体称为Cascade，它与crRNA结合进行靶标识别，促进crRNA与其互补的靶DNA形成双工，形成R-loop，并招募Cas3核酸酶进行DNA的降解。I型系统已经发展成为各种微生物基因组操作工具，如同源修复模板基因组编辑工具、转录调控工具、大片段删除工具、不需要同源重组的大片段整合工具，以及同时使用Cascade-Cas3进行基因组编辑和基因调控的工具。自2019年以来，几种I型亚型已成功用于真核生物基因组操作。当Cascade和Cas3同时表达时，Cas3表现出外切酶活性，导致高达200kb的大片段缺失。I-D型也报道了类似的活性，其中Cas10是一种功能性核酸酶，同时也检测到短索引。Cas3与胞苷脱氨酶的融合可以实现广泛的随机突变，覆盖范围高达55 kb，这为优化复杂的生物合成途径提供了有效的工具。此外，Cascade可以与不同的域融合以实现不同的功能。当Cascade融合到二聚化依赖性、非特异性的FokI核酸酶结构域时，其编辑效率与dCas9 -FokI相当。 当Cascade融合到转录激活或抑制域时，可以调节目标内源基因的表达水平。

最小型I-F2 CRISPR-Cas系统（图源自 Nature Communications ）

然而，真核生物中使用的Cascades包括4或5个亚基，Cas6将前体crRNA (pre-crRNA)加工成成熟的crRNA。 例如，大肠杆菌(E. coli) K12型I-E级联系统由5个亚基组成，总基因大小约为4.4 kb。 乳糖奈瑟球菌 ATCC 23970型I-C级联系统由4个亚基组成，包括隐藏的小亚基在内，总基因大小约为3.8 kb。大尺寸阻碍了货物尺寸限制的应用，例如广泛应用的腺相关病毒(AAV)载体，其包装限制约为4.7 kb，这阻碍了大多数CRISPR工具的临床应用。 因此，挖掘更紧凑的I型系统将有助于将I型基因组操作工具应用于真核生物。

另一方面，R环的形成是CRISPR系统的一个重要特征。 在R环结构中，被crRNA的间隔器置换的非靶DNA链暴露出来，其他分子可以访问，这是碱基编辑技术所利用的。通过将单链DNA (ssDNA)脱氨酶或糖基化酶融合到催化受损的Cas核酸酶上，碱基编辑器可以在不需要双链DNA (dsDNA)断裂或供体DNA模板的情况下安装各种碱基转换。然而，碱基编辑器主要是用催化受损的Cas9或Cas12开发的。值得注意的是，与Cas9或Cas12相比，I型系统形成的R环相当宽，跨度约为30-40 nt。Cas9或Cas12的R环较窄，约为20 nt。I型系统中延伸的R环可能为ssDNA脱氨酶或糖基化酶提供更多的核苷酸底物，从而扩大靶向位点。 因此，探索I型系统在碱基编辑中的潜力对于开发具有广泛编辑的碱基编辑器是有价值的。

研究了紧凑型I-F2系统在人体细胞中的应用。 I-F2型系统具有迄今为止发现的最紧凑的级联，由Cas5、Cas6和Cas7组成，没有大亚基(Cas8)或小亚基(Cas11)。总基因大小明显小于SpCas9，使其更容易在真核生物中传递。然而，以前将该系统应用于真核生物的尝试并不成功。研究提出了一个紧凑的I-F2型系统来操纵人类基因组。Cascade来源于Mos350，总基因大小约为2.7 kb，倾向于一个简单的5 ' -CC protospacer邻基序(PAM)。通过将转录激活域与Cascade融合，可以调节人类细胞中的基因表达，并通过crRNA和Cascade工程实现强大的活性。此外，通过将脱氧腺苷脱氨酶与Cascade融合，研究开发了I-F2型系统的碱基编辑器。有趣的是，这种腺嘌呤碱基编辑器(ABE)诱导了一个宽的编辑窗口(~30 nt)，具有双峰分布，可以实现超过50%的编辑效率。具有宽编辑窗口的I-F2 ABE可用于遗传筛选和破坏功能序列。 这些结果突出了紧凑型I-F2系统在真核生物中的潜力，并扩展了碱基编辑工具箱。