单细胞+线粒体自噬+肿瘤转移，构建基于线粒体自噬的预后模型

方法

结果

目的： 通过单细胞转录组分析 OSA 转移中的细胞异质性，特别是关注与线粒体自噬相关的基因表达。

结果：

1. 用小提琴图展示数据质控结果（图1A）；

2. UMAP 图展示合并数据聚类结果（图1B）；

3. 通过细胞类型注释识别了11种细胞类别，并用已知亚型标记列表进行验证（图1C-F）；

4. 原发性和转移性骨肉瘤组织之间存在细胞类型的组成差异，特别是在骨细胞和 NKT 细胞的比例上（图1D）。

目的： 揭示 OSA 转移过程中线粒体自噬通路活性的动态变化，以及这些变化与肿瘤进展之间的关系。

结果：

1. 在骨肉瘤的不同细胞亚群中，线粒体自噬通路活性存在显著的异质性，其中软骨细胞和成骨细胞较明显，后者则表现出与恶性肿瘤相关的更明显的活性（图2A）；

2. 对成骨细胞数据重分析并用 UMAP 图进行可视化（图2B）；

3. 通过 AddModuleScore 函数量化不同骨细胞亚群中线粒体自噬通路的活性后，发现成骨细胞簇3的线粒体自噬活性最高，而成骨细胞簇11的线粒体自噬活性最低（图2C）；

4. 成骨细胞簇3在原发性肿瘤中表现出较低的表达，但在转移性肿瘤中表现出较高的表达，而成骨细胞簇2和成骨细胞簇 4 表现出相反的模式（图2D）；

5. 转移组和原发组之间的细胞类型分布明显不同，这些细胞类型按不同的线粒体自噬活性表达进行分类（图2E）。

目的： 探究线粒体自噬如何调节 OSA 中骨细胞细胞间的通讯。

结果：

1. 不同线粒体自噬活性水平的骨细胞在细胞间通讯中表现出显著差异，特别是在信号的发送和接收强度上（图3A-D）；

2. 低线粒体自噬活性的骨细胞与周围细胞（如周细胞、 NKT 细胞、髓系细胞和成纤维细胞）的通讯更为活跃，而高线粒体自噬活性的骨细胞与内皮细胞的通讯更为活跃（图3E）；

3. 进一步分析发现不同线粒体自噬活性水平的骨细胞在 PTN、PERIOSTIN、MIF、VISFATIN、VEGF 等信号通路中扮演的角色，这些通路在肿瘤的凋亡、细胞因子活性、细胞外基质和受体结合、生长因子活性以及酶抑制等方面发挥作用。

目的： 揭示 OSA 中骨细胞对线粒体自噬变化的调节反应。

结果：

1. 拟时序分析揭示了成骨 OSA 细胞从早期分化状态到晚期分化状态的动态变化过程（图4A，B）；

2. 分化过程中原发性 OSA 细胞和转移性 OSA 细胞的分布如图4C所示；

3. 成骨细胞不同亚群沿细胞分化轨迹的分布如图4D所示；

4. 通过整合线粒体自噬活性的差异，发现代谢活性最高的成骨细胞簇3主要位于细胞分化轨迹的后期，与转移性骨肉瘤组织相关；而代谢活性最低的成骨细胞簇11主要分布在分化早期，与原发性骨肉瘤组织相关，进一步支持了线粒体自噬活性与 OSA 转移之间的密切关联。

目的： 基于线粒体自噬相关基因（ MRGs ）构建的风险评分模型，以预测骨肉瘤患者预后。

结果：

1. 利用多变量 Cox 回归分析筛选出三个线粒体自噬相关预后基因（ RPS27A、TOMM20和UBB ），并基于它们的表达水平和系数构建了 MIP_score 模型（图6A，B）；

2. 根据 TCGA 训练数据集中的中位 MIP_score ，将患者分为低风险组和高风险组；

3. Kaplan-Meier 生存分析显示，低风险组患者的总体生存率显著高于高风险组患者（图5A）；

4. 时间依赖的 ROC 分析显示 MIP_score 在1年、3年和5年的AUC值分别为0.974、0.848和0.808，表明 MIP_score 具有强大的预后预测准确性（图5B）；

5. 热图展示了 OSA 患者的风险评分分布、生存状态和三个候选基因的表达（图5C）；

6. 通过 TCGA 测试队列和 GSE21257 数据集进一步验证了 MIP_score 模型的预后准确性（图5D-I）。

目的： 评估三个关键 MRGs 在 OSA 中的预后价值和它们在肿瘤进展中的作用。

结果：

1. 根据多变量 Cox 分析的结果，在 TCGA 队列中构建了预后列线图模型，证实 MIP_score 可作为一个独立预后因素（图6C）；

2. DCA 显示该模型具有显著的临床应用潜力（图6D）；

3. ROC 分析显示， MIP_score 在预测3年和5年生存率上的 AUC 值分别为0.738和0.755，具备良好的预测性能（图6E，F）；

4. GSVA 和 GSEA 分析表明， MIP_score 与细胞凋亡、氧化损伤、炎症反应等多个生物学过程相关（图6G-I）；

5. 免疫细胞浸润分析显示 MIP_score 与多种免疫细胞的浸润减少相关，进一步证实了 MIP_score 作为独立风险因素的作用。

目的： 通过药物敏感性预测分析寻找潜在治疗药物。

结果：

1. 低 MIP_score 的患者对 Bexarotene、JNK.Inhibitor 等药物显示出更高的敏感性，而高 MIP_score 的患者则显示出对这些药物的耐药性（图7A）；

2. MIP_score 能够预测患者对标准抗骨肉瘤化疗的反应，高 MIP_score 的患者对化疗的反应较差，需要更高的药物浓度才能达到相似的抑制效果（图7B）。

目的： 确认 OSA 细胞系中具有更高转移潜力的细胞是否表现出增强的线粒体自噬活动。

结果：

1. JC-1检测显示高转移性143B细胞的线粒体膜电位降低（图8A）；

2. 溶酶体和线粒体的共染色表明143B中的线粒体自噬水平高于Mg63（图8B）；

3. 这些发现证实 OSA 中线粒体自噬增加与转移潜能增强之间存在正相关性。

目的： 探究 RPS27A 对 OSA 细胞转移能力的影响，特别是其对线粒体自噬的影响。

结果：

1. MRGs 对 OS252、SJSA1、143B、SAOS2、U2OS、G-292、HSOS1 等8个细胞株有显著影响，其中 RPS27A 最重要，因此将 RPS27A 作为后续实验的重点（图9A-C）；

2. RT-PCR 分析显示 OSA 细胞系中 RPS27A 的表达水平显著高于正常成骨细胞（图9D）；

3. RT-PCR 分析表明所有 shRPS27A 构建体均有效下调 RPS27A 表达，因此后续利用 shRPS27A 对 RPS27A 表达进行调低（图9E）；

4. RPS27A 敲低后， OSA 细胞的增殖、侵袭和迁移能力显著降低，凋亡增加（图9F-K）；

5. 免疫荧光和共聚焦显微镜观察显示 RPS27A 敲低减少了线粒体自噬；

6. 裸鼠模型实验表明， RPS27A 敲低显著抑制了 OSA 细胞的生长和转移；

7. 这些结果表明 RPS27A 通过影响线粒体自噬在调节 OSA 细胞的恶性行为中起着至关重要的作用。