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福建物构所陈学元：氧化石墨烯修饰稀土纳米探针及肿瘤靶向可见-近红外二区发光成像

研之成理 · 公众号 · 科研 · 2019-11-10 07:00

正文

▲第一作者：宋晓荣

通讯作者：陈学元，杨黄浩

论文链接：Graphene Oxide Modified Lanthanide Nanoprobes for Tumor-Targeted Visible/NIR-II Luminescence Imaging (Angew. Chem. Int. Ed. 2019, DOI: 10.1002/anie.201909416)

研究背景

荧光成像因其高灵敏度、高分辨率、实时多色成像和无损性等特征，为生命体内重要生理过程与疾病信息的成像研究提供了技术，是实现疾病精准诊疗的重要工具之一。在荧光成像探针中，稀土发光纳米探针具有发光寿命长、量子产率高和发光波长可调等优点，在体外诊断与医学影像研究中受到广泛关注。特别地，稀土离子可以通过连续吸收两个或两个以上的近红外光子（例如 808 nm 或 980 nm），发射上转换可见-近红外一区发光（400-800 nm）和下转移近红外二区发光（1000-1700 nm），这能够显著克服传统荧光探针在紫外-可见光激发下的高荧光背景和生物组织对可见光的吸收与散射，提高活体成像的组织穿透深度和灵敏度。

目前，稀土纳米晶的可控合成与发光调控已经取得了较好的发展，但是高质量的稀土纳米晶通常在油相中合成，如何将油相分散的稀土纳米晶设计成具有良好水溶性、生物相容性以及探针识别能力的纳米探针仍然存在诸多挑战。

针对这一现状，中科院福建物质结构研究所 陈学元 团队与福州大学化学学院 杨黄浩 团队合作，提出通过氧化石墨烯修饰稀土纳米晶的探针功能化新策略，实现了高灵敏的肿瘤靶向可见-近红外二区发光成像。团队通过优化稀土纳米晶的壳层结构与氧化石墨烯的尺寸大小，获得了单分散的、具有高效上转换/下转移发光性能的氧化石墨烯包覆稀土纳米晶二元纳米结构（NCs@GO）。

利用氧化石墨烯的两亲性、高比表面积和丰富官能团等理化性质，NCs@GO 不仅具有广谱溶剂分散性和优异的生物相容性，也可以通过简单的非共价键修饰进一步与核酸、蛋白质或纳米颗粒偶联实现探针功能化。团队利用此类稀土纳米探针成功实现了肿瘤细胞内纳米探针的实时定位追踪和 microRNA 的可视化成像，以及小鼠肿瘤靶向的无背景高灵敏近红外二区发光成像。

▲图1 a）NCs@GO 合成示意图；b）NaYF ₄ :Yb,Er 内核与 c）NaYF ₄ :Yb,Er@NaYF ₄ 核壳结构的TEM明场像；d）GO 的 AFM 表征图，内插图：GO 纳米片的高度分布图；e，f）NCs@GO的TEM明场像（箭头指示为GO包覆层）；g）NCs@GO 的高分辨TEM明场像。

结果与 讨论

2.1 NCs@GO 的可控合成

我们首先采用高温共沉淀法合成了尺寸均一的 NaYF ₄ :Yb,Er@NaYF ₄ 核壳结构纳米晶，并通过 Hummer 法结合水相超声剥离法制备得到氧化石墨烯分散液，通过 XRD、TEM、AFM、DLS和Raman 等表征证实了单分散稀土纳米晶与单层氧化石墨烯的成功合成。基于氧化石墨烯具有疏水的中心碳结构和亲水的边缘羧基与羟基，我们预期氧化石墨烯可作为表面活性剂用于包裹疏水性稀土纳米晶，并赋予其良好的亲水性。为此，我们将氧化石墨烯水溶液与稀土纳米晶环己烷溶液混合，经剧烈搅拌后，高产率地获得了具有优异水相分散能力的 NCs@GO，TEM 表征显示了单颗粒稀土纳米晶的氧化石墨烯包覆（图1）。

为了阐明稀土纳米晶的壳层厚度和氧化石墨烯的尺寸对 NCs@GO 的形貌及发光性能的影响，我们分别制备了两种尺寸的氧化石墨烯（80，300 nm）和不同壳层厚度的核壳稀土纳米晶（0，2.0，3.3 nm）。结果显示，300 nm 尺寸氧化石墨烯倾向于将多个稀土纳米晶包裹成一团，形成纳米晶组装体；然而，80 nm 尺寸氧化石墨烯能够高效地包裹单颗粒稀土纳米晶，获得单分散的、水分散性良好的NCs@GO（图2a-c）。980 nm 激发下的上转换发光性能测定表明，随着纳米晶壳层厚度的增大，NCs@GO 的发光强度逐渐增强。激发态动力学测试显示 NCs@GO 中稀土纳米晶与氧化石墨烯之间的能量转移效率（η）随着壳层厚度的提高（0-3.3 nm）而逐渐降低（η = 33.3，26.7，21.2%），表明壳层厚度的提高使纳米晶与氧化石墨烯之间的能量转移被有效抑制（图2d-g）。因此我们选择以 80 nm GO 和 3.3 nm 核壳纳米晶制备的具有最强上转换/下转移发光性能的 NCs@GO 用于后续研究（图2h）。

▲图 2 a-c）不同厚度 NaYF ₄ 壳层 NCs 合成的 NCs@GO 的 TEM 明场像；b）去配体的 NCs 与相应 NCs@GO 的发光强度对比图；e-g）Er ³⁺ ⁴ F _9/2 能级的荧光衰减曲线，其发光寿命通过单指数拟合得到；h）NCs@GO 在 980 nm 激光激发下的可见-近红外发射光谱（500-1650 nm），内插图：NCs@GO 水溶液照片与在 980 nm 激光激发下的 UCL/DSL 成像图。

2.2 NCs@GO 的表面性质

NCs@GO 不仅具有良好的水相分散性，也表现出独特的广谱溶剂可分散性和表面功能化能力。NCs@GO 能够很好地分散在一系列具有不同介电常数的溶剂中（ε _r ：15.6~80.1），且其颗粒尺寸未有明显变化（图3a, 3b）。特别地，NCs@GO 可以通过非共价键修饰进行进一步表面功能化。例如，NCs@GO 能够可控且稳定地修饰上牛血清白蛋白，还可以与 Au NPs 形成具有不同 NCs@GO/Au NPs 比例的 NCs@GO-Au 三元纳米结构（图3c-f）。因此，NCs@GO 的优异表面性质将有助于高性能纳米探针的设计与成像应用。

我们还发现氧化石墨烯的表面包覆可以改善稀土纳米晶与细胞间的作用。细胞共定位染色实验表明 NCs@GO 与细胞作用后，首先进入细胞溶酶体（2 h），随着培养时间的延长（6 h），NCs@GO 可以部分地从溶酶体逃逸。通过监测细胞在不同条件下的纳米材料吞噬量，我们发现 NCs@GO 表现出能量与时间依赖的细胞吞噬性能。更有意义的是，与传统表面配体修饰的亲水性稀土纳米晶相比（例如去配体的纳米晶和聚丙烯酸修饰的纳米晶），NCs@GO 具有更强的细胞吞噬能力和更低的细胞毒性。这种高效的细胞吞噬性能可能是由于 NCs@GO的不规则粗糙表面引起的多途径细胞内吞作用。

▲图3 NCs@GO 分散于不同介电常数溶剂中的 a）水溶液照片图与b）DLS粒径表征图；c）NCs@GO 对牛血清白蛋白的负载效率曲线；d-f）不同 Au NPs 负载比例下的 NCs@GO-Au 三元纳米结构的 TEM 明场像。

2.3 NCs@GO 实现肿瘤 细胞内 探针定位 追踪与 microRNA 可视化 成像

氧化石墨烯作为优异的载体材料，已在细胞递送和分子成像等领域受到广泛研究，然而如何同时实现细胞内的载体追踪与肿瘤分子成像仍然存在挑战。为此，我们设计通过氧化石墨烯与核酸碱基的π堆积作用对 NCs@GO 修饰上染料标记的核酸以构建 “turn-on” 型纳米探针（NCs@GO-DNA），并利用 microRNA-21（miR-21）操纵核酸上染料与氧化石墨烯的荧光共振能量转移（FRET），实现 miR-21 的高灵敏可视化成像。

我们首先考察了该纳米探针在复杂生理条件下的核酸吸附稳定性，证实了纳米探针的良好稳定性和检测特异性。当纳米探针进入肿瘤细胞时，我们可以利用稀土纳米晶的上转换发光性能实现肿瘤细胞内纳米探针的无背景定位追踪；同时，肿瘤特异性高表达的 miR-21 能与染料标记的核酸序列互补杂交，并使核酸探针从氧化石墨烯表面脱附以抑制染料与氧化石墨烯的 FRET，从而利用染料荧光实现 miR-21 的高灵敏特异性成像。因此，NCs@GO 能够同时实现肿瘤细胞中纳米探针定位追踪与目标分子的高灵敏成像。

▲图4 a）NCs@GO-DNA 纳米探针用于 miR-21 检测的原理示意图；b）NCs@GO 对 DNA-FAM的荧光猝灭性能表征图；c）NCs@GO-DNA在miR-2 1响应下的荧光恢复表征图；d）NCs@GO-DNA探针与对照探针分别和 miR-21 高表达 MCF-7 细胞与 miR-21 低表达 LO2 细胞的共聚焦荧光成像图，NCs@GO 的上转换发光和 FAM 的荧光分别通过 980 nm 和 480 nm 激发；标尺：25 μm。

2.4 NCs@GO 用于小鼠肿瘤靶向 的 近红外二区 发光成像

基于 NCs@GO 的高效近红外二区发光性能与靶向功能化修饰，我们进一步利用 NCs@GO 实现了小鼠肿瘤靶向的高灵敏近红外二区发光成像。具体地，我们首先制备了抗 EpCAM 抗体修饰的 NCs@GO（NCs@GO-Ab），其能够靶向地结合广谱肿瘤细胞表面高度表达的特异性抗原 EpCAM。细胞共聚焦荧光成像表明，NCs@GO-Ab 比磷脂聚乙二醇修饰的 NCs@GO（NCs@GO-PEG）具有更高的肿瘤细胞标记能力，证实了 NCs@GO-Ab 的肿瘤细胞靶向性。

同时，通过近红外二区发光成像监测，我们可以清晰看到在尾静脉注射后近红外二区信号先后出现在心脏、肝脏和血管等部位。血液代谢动力学与小鼠近红外二区发光成像同时证实了纳米探针优异的血液循环性能。随着注射时间的延长，小鼠肿瘤部位的近红外二区荧光信号逐渐增强。特别地，在尾静脉注射 10 h 后，注射 NCs@GO-Ab 的小鼠肿瘤中的荧光强度是注射 NCs@GO-PEG 的 2.1 倍。小鼠组织分析与元素分析验证了 NCs@GO-Ab 在小鼠肿瘤中的靶向富集以及纳米探针的良好生物相容性。

▲图 5 a）小鼠经尾静脉注射 NCs@GO-PEG 后的 NIR-II 成像图；b）小鼠肿瘤靶向的 NIR-II 成像示意图；c）注射 NCs@GO-PEG 后小鼠心脏、肝脏、血管处的NIR-II信号强度变化图；d）不同注射时间后小鼠肿瘤区域的 NIR-II 成像信噪比；e）小鼠 NIR-II 荧光成像图。

结论

我们发展了一种基于氧化石墨烯直接包覆稀土纳米探针的功能化策略。利用 NCs@GO 二元结构的优异上转换/下转移发光性能以及氧化石墨烯的独特表面性质与生物学功能，我们开发了新型稀土纳米探针，其与传统纳米探针相比具有四个方面的显著优势：

1）更高效的上转换/下转移发光性能与优异的广谱溶剂可分散性；

2）无需复杂共价键修饰过程即可实现核酸、蛋白质和纳米材料等的功能化修饰；

3）增强的细胞吞噬性能与生物相容性；

4）可定制设计的多功能纳米探针。

我们示例证实了 NCs@GO 可以实现细胞内纳米探针的无背景荧光定位追踪与目标分子的可视化成像以及小鼠肿瘤靶向的近红外二区发光成像。该工作为具有特殊表面性质与生物功能的稀土发光纳米探针的设计提供了新思路，将推动新型纳米探针在肿瘤成像与治疗中的应用。

陈学元团队简介

陈学元，中国科学院福建物质结构研究所研究员。1993 年毕业于中国科技大学材料科学与工程系，1998 年获中科院福建物质结构研究所物理化学专业理学博士学位。2001-2005 年美国阿贡国家实验室从事博士后研究。2013 年获得国家杰出青年科学基金（结题优秀）。入选科技部中青年科技创新领军人才，国家“万人计划”科技创新领军人才，国家百千万人才工程并被授予“有突出贡献中青年专家”称号。担任 Journal of Luminescence 主编， Physics Open 常任编辑， Nano Research 、 Science China Materials 、 Journal of Rare Earths 等期刊编委。

近年来致力于发光材料电子结构与性能研究，在无机纳米发光材料控制合成、电子结构、光学性能及应用取得重要进展，已在 Nat. Photonics , Nat. Commun. , J. Am. Chem. Soc. , Angew. Chem. Int. Ed. , Adv. Mater. 等刊物发表 SCI 论文 200 多篇，被引用总次数>1.2 万次，16 篇论文入选近十年化学、材料和物理领域ESI高被引频次论文（top 1%）；出版《稀土纳米发光材料：从基础到生物应用》等 Springer 英文专著 2 部，专章 6 篇；申请国内外发明专利 55 项（授权30项）。系列研究成果获 2018 年度中国稀土科学技术奖一等奖（基础研究类），2017 年度福建省自然科学奖二等奖，入选年度 "中国光学重要成果" （2010，2011，2013，2014，2016）和 “中国稀土十大科技新闻”（2011，2014，2015，2016，2018）。

团队网页 :

http://fjirsm.cas.cn/xchen

原文链接：

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/anie.201909416

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