核糖体在基因表达调控中十分重要，尤其是通过核糖体相关蛋白（RAPs）来调控翻译。RAPs在神经发育和免疫反应等许多生物过程中发挥重要作用，但由于缺乏有效的识别不同组织和细胞类型中的 RAP 的方法，难以对它们进行深入研究。常见的研究方法具有缺乏特异性、依赖遗传编辑和处理步骤繁琐的缺陷：密度或大小分离法，通过密度或大小对细胞裂解物进行分级，缺乏特异性【1】；Ribo-FLAG免疫沉淀（IP）法，则依赖于核糖体核心蛋白（RPs）上标记FLAG标签的遗传标记，无法在组织或患者样本中应用【2】；活性核糖体捕获-MS（ARC-MS）是一种使用Click化学来分离核糖体和RAPs的新化学方法，需要样本处理（如使用叠氮基高代氨酸），并且倾向于识别翻译早期阶段的核糖体，导致样本偏向【3】。近日，斯坦福大学的Maria Barna和UCSF的Davide Ruggero团队合作在Molecular Cell上在线发表了题为RAPIDASH: Tag-free enrichment of ribosome associated proteins reveals composition dynamics in embryonic tissue, cancer cells, and macrophages的文章，开发了一种叫做RAPIDASH的RAPs富集方法，能够跨越多种样本类型和环境，富集并分析核糖体相关蛋白的组成动态。RAPIDASH方法用一种带有巯基的硫键树脂，通过与核糖体RNA的特异性结合，富集核糖体及其相关的蛋白质。RAPIDASH显著富集了核糖体蛋白，较以往的超速离心方法，RAPIDASH显现出更高的特异性和有效性，能够识别大多数核糖体蛋白及相关的翻译因子。
图1：RAPIDASH流程示意图：细胞质裂解物经过蔗糖垫超速离心和巯基树脂层析，富集含有RNA的高分子量复合物。
研究团队使用这种方法处理了多种生物样本，包括小鼠胚胎组织、癌细胞和受刺激的巨噬细胞，并通过质谱分析（MS）鉴定富集的蛋白质，研究RAPs的动态变化。他们将RAPIDASH技术应用于小鼠E12.5阶段的胚胎组织，包括前脑、肢体和肝脏，富集并分析这些组织中的RAPs，发现前脑中特异性富集的RAPs（如Dhx30和LLPH）可能与神经发育相关，例如，LLPH在长mRNA转录本的翻译中起关键作用，这对神经系统的发育至关重要。为了探索核糖体组成如何在肿瘤进展中发生变化，他们将RAPIDASH技术应用于前列腺癌细胞系PC3，分析在抑制mTOR信号通路前后，核糖体及其相关蛋白的变化。通过质谱分析鉴定核糖体相关蛋白的变化，发现在抑制mTOR信号后，eIF4G1等翻译起始因子与核糖体的结合减少，这表明mTOR信号通路调控了特定RAPs的翻译功能。他们还探究了巨噬细胞在免疫激活后的RAP重构，通过RAPIDASH技术富集巨噬细胞在TLR3和TLR4免疫激活后不同时间点的核糖体，分析其组成的动态变化，发现免疫激活后，许多参与抗病毒反应的RAPs如IFIT家族蛋白显著富集。这一结果表明，核糖体不仅是蛋白合成的机器，还参与了免疫反应的调控。综上所述，这个研究验证了RAPIDASH技术在小鼠胚胎干细胞中的应用，并将这个技术应用于组织特异性功能中。同时癌细胞和免疫细胞中的实验展示了RAPIDASH技术能揭示癌症和免疫反应中核糖体的动态变化。https://doi.org/10.1016/j.molcel.2024.08.023
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1. Mehta, P., Woo, P., Venkataraman, K., and Karzai, A.W. (2012). Ribosome purification approaches for studying interactions of regulatory proteins and RNAs with the ribosome. Methods Mol. Biol. 905, 273–289. https://doi.org/10.1007/978-1-61779-949-5_18.2. Simsek, D., Tiu, G.C., Flynn, R.A., Byeon, G.W., Leppek, K., Xu, A.F., Chang, H.Y., and Barna, M. (2017). The mammalian ribo-interactome reveals ribosome functional diversity and heterogeneity. Cell 169, 1051– 1065.e18. https://doi.org/10.1016/j.cell.2017.05.0223. Bartsch, D., Kalamkar, K., Ahuja, G., Lackmann, J.-W., Hescheler, J., Weber, T., Bazzi, H., Clamer, M., Mendjan, S., Papantonis, A., et al. (2023). mRNA translational specialization by RBPMS presets the competence for cardiac commitment in hESCs. Sci. Adv. 9, eade1792. https://doi.org/10.1126/sciadv.ade1792.
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