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上周，一项研究声称CRISPR-Cas9基因组编辑技术比预期中的更容易发生错误，这让它成为了全世界的头条新闻。也因此，一些投资者出售他们持有的基于CRISPR的生物技术公司的股票，这导致一些公司的股票价格下降高达15%。但是，这项最新的CRISPR报道能够证明所有的这种恐慌是正当的吗？
图片来自iStock/Vchal。
开发基于CRISPR的疗法的科学家们和公司不同意这一点，指出这种证据存在缺陷。再者，投资公司Cowen生物技术股票分析员Ritu Baral说，早在将这些疗法提交给监管结构之前，CRISPR业内人士就充分意识到需要对脱靶突变进行筛选和对技术进行优化。“所有的这一切都在幕后发生着，但是非专业人士和散户投资者可能没有意识到这一点。”
在这项于2017年5月30日在线发表在Nature Methods期刊上的研究中，对脱靶效应的分析源自美国哥伦比亚大学的Stephen Tsang及其同事们在2016年开展的一项研究：他们利用CRISPR-Cas9技术成功地修复小鼠胚胎中一种导致失明的基因突变。在该项研究完成后，论文共同作者、美国斯坦福大学眼科医师VinitMahajan发现有机会研究酶Cas9如何容易发生错误。
科学家们总是承认CRISPR并不是完美的。计算机算法已被开发出来用于鉴定基因组上与向导RNA（gRNA）序列存在相似性的位点。迄今为止，已有研究提示着CRISPR技术的脱靶突变率通常是较低的，但是Mahajan解释道，“我们想要付出我们应有的努力来观察CRISPR-Cas9是否可能偶然地靶向其他的位点。”
Mahajan和他的同事们对来自他们的2016年那项研究中储存的组织样品的基因组进行测序，并且将它们与已发表的小鼠序列数据进行比较。在这些组织样品序列中存在的但在公共序列数据库中不存在的突变被鉴定为CRISPR介入导致的脱靶突变。
Mahajan团队对这些结果感到吃惊：两只接受CRISPR处理的小鼠发生的突变比预期中的多10倍。更令人担忧的是，在这些突变中，没有一种突变存在于利用计算机算法预测到的Cas9脱靶位点之内。
Mahajan告诉《科学家》杂志，“这些全基因组序列似乎在未被预测的区域中发生突变。这提示着利用体外培养的细胞开展的实验可能并不能较好地预测当被注射到整个有机体内时，CRISPR蛋白是如何作出表现的。”
Mahajan说，利用预测性算法仅在基因组的蛋白编码区域中寻找潜在的脱靶位点，可能会遗漏一些突变。非编码区域“在调节基因和调节细胞中发挥着重要的作用”，但是他承认，“我们迄今为止不能够预测在这些区域中的突变如何可能影响整个有机体。”他说，尽管这些小鼠存在新的突变，但是在他的研究中，它们看起来很正常。
Mahajan提醒道，“这是一项非常小型的针对性研究：探究了小鼠中的单个基因。我们需要开展更多的研究来理解脱靶效应如何发挥作用，以及它如何在不同的情形下出现。”
澳大利亚国立大学遗传学家GaétanBurgio说，他对这一发现并不感到吃惊。他说，“不同寻常之处在于这种脱靶效应的幅度”，不过他指出这种结果存在其他的解释。Burgio告诉《科学家》杂志，“很多脱靶突变不可能是由CRISPR导致的。”
Burgio继续说道，这项研究存在的一个重大的缺陷是采用已发表的序列数据，而没有设置对照小鼠，即放置在相同的实验室条件下但未接受Cas9蛋白注射的动物。“在你的研究机构中使用的小鼠与那些已被测序过的小鼠存在基因漂移。”Burgio说，由于这一点，这项研究不能够“梳理出哪些变异体是由于自然的基因变异导致的，哪些变异体是与CRISPR相关的。”
为了支持这种看法，批评者注意到这两只小鼠都具有很多相同的纯合突变，这意味着相同的变异体存在于染色体的两个拷贝上。这提示着它们可能是从一个相同的祖先遗传下来的，而且在进行CRISPR处理之前就已存在于这些小鼠体内。Burgio说，“就我的个人经验而言”，利用CRISPR-Cas9在两只不同的小鼠中“产生两种完全一样的点突变是非常罕见的”。
Mahajan承认，“我认为我们不能够100%确信它们都是由CRISPR导致的。这种CRISPR系统和实验步骤存在着很多注意事项。”
批评者也声称这篇论文存在着明显的错误，比如不正确地鉴定脱靶位点，这可能影响着这些结果的可靠性。Mahajan并没有提供详细的反驳意见，但是将这些批评意见描述为是“非常错误的”。
不过，这项小型的初步研究足以吸人眼球，吓坏投资者，比如几家使用CRISPR基因编辑系统的生物技术公司看到它们的股票价格下降高达15%。Baral说，这种反应是较为罕见的，“但是当你的研究领域非常引人关注时，发生这种情形绝对不是没有听说过的。”
作为对这项研究的回应，Intellia Therapeutics公司在发送给《科学家》杂志的电子邮件中声称，“这项研究存在缺陷”，而且“这些作者们没有为这些所谓的脱靶编辑考虑过其他的更加简单的解释”。他们强调，他们正在进行的研究旨在为开发CRISPR疗法，“发现治疗上相关的gRNA，并且不存在可检测到的脱靶编辑”。
EditasMedicin公司也同意这一点，在一封电子邮件中写道，他们“严格地评估了我们的分子的特异性”，并且“已证实我们能够制造出没有可检测到的脱靶效应的CRISPR分子”。
Baral说，她认为这些结果并不是引发重大关切的原因。“我认为在进行科学研究时，它会遭遇到非常高水平的安全审查. . . .这提示着这些公司为它们的疗法进行临床前开发所花费的时间是完全合理的。”
Mahajan也仍然保持乐观。他说，“我仍然对CRISPR感到激动人心”，但是他补充道，学术界需要解决一些问题，比如在真实的组织中发生的脱靶突变率，这些突变对活的有机体的影响。他说，如果脱靶突变与他的数据所提示的那样比较常见，那么对患上绝症或衰弱性疾病且没有替代疗法的病人而言，这种风险可能仍然是值得关注的。
参考资料：
1.Kellie A Schaefer, Wen-Hsuan Wu, Diana F Colgan et al. Unexpected mutations after CRISPR–Cas9 editing in vivo. Nature Methods, Published online: 30 May 2017, doi:10.1038/nmeth.4293
2. Was a Drop in CRISPR Firms’ Stock Warranted?
3. Comment to Unexpected mutations after CRISPR-Cas9 editing in vivo
4. 泼冷水！Nature子刊“大发现”：CRISPR可引发数百种“意外突变”！
