从重庆医科大学这篇NC看“小分子、代谢物、肠道菌群”要发到10+需要做哪些工作？

“细胞衰老”是大家非常关注的科研热点之一，今天我们介绍的这项研究是重庆医科大学团队发表在 Nature Communications 期刊上的研究。之所以介绍这篇 NC 的研究， 是因为这类研究代表了从小分子药物、代谢物、肠道菌群等角度深入系统的开展研究的一个策略（ 一般这类研究都能发在 10+ 的期刊上 ），也是大家申请国自然项目的时候可参考的模板。

下面我们看一下这项研究主要的发现：

1 ）研究关注的切入点是从“药食同源”的蜂王浆的成分中链脂肪酸 10-HDA （ 关键小分子 ） 对 软骨退行性变化和疼痛 （ 临床疾病 ） 的改善角度进行的研究，值得一提的是： 10-HDA 的药理和生物活性也已被报道用于其他疾病，如 类风湿性关节炎（ RA ）、结肠癌、结直肠癌、神经炎症、骨骼肌萎缩、细菌感染、结肠炎、各种实体瘤和骨质疏松症 。

2 ）在对细胞影响的具体作用上，研究发现 10-HAD 通过 抑制“软骨细胞衰老” （ 细胞表型 ） 从而改善软骨退行性变化和疼痛，并且与 ERK/p53/p21 和 GSK3 β /p16 信号轴有关；

3 ）下面就是这项研究的一个关键问题了： 10-HAD 是如何抑制“软骨细胞衰老”的？其具体的靶点是什么？ 研究团队通过 DARTS （药物亲和力响应靶标稳定性）和 CETSA （细胞热位移分析）技术鉴定 ASPH 为 10-HDA 的靶蛋白（ 小分子的靶点 ）；关于 DARTS 和 CETSA 技术的介绍大家可看推文： 国自然申请|“小分子药物-蛋白互作”的7种常用技术，让专家“眼前一亮”的技术来了！ ；

4 ） 那 10-HAD 与 ASPH 结合后以及下游通路和细胞衰老的影响是怎样的？ ASPH 是天冬氨酸β - 羟化酶（ ASPH ），研究发现 ASPH 下游有两条通路： ERK/p53/p21 和 GSK3 β /p16 ，其中 1 ） 10-HDA 通过与 ASPH 结合，增强了 ERK 的磷酸化（ p-ERK ），同时 抑制了 p53 的磷酸化（ p-p53 ）及其下游的 p21 表达 （ 下游通路 1 ）； 2 ） ASPH 还通过直接与 GSK3β 相互作用来调节其活性， 抑制 GSK3β 的活性可以减少 p16 的表达 （ 下游通路 2 ）。到 p53 、 p21 和 p16 大家就很熟悉了，这是与细胞衰老相关的明星分子了。

5 ） 10-HAD 与 ASPH 作用的具体位点是什么？这种结合对 ASPH 蛋白的影响什么？ 研究发现 10-HDA 与 ASPH 的结合具体发生在 ASPH 的 Asp_Arg_Hydrox （ 591-745 ）结构域的糖基化位点（ 具体结构域和氨基酸位点 ） ，特别是氨基酸位点 706 ； 10-HDA 能够保护 ASPH 蛋白不受蛋白酶的水解， 并且这种保护作用依赖于 ASPH 的 Asp_Arg_Hydrox 结构域，因此总的来说 10-HDA 通过与 ASPH 的糖基化位点结合， 增强了 ASPH 蛋白的热稳定性（ 对靶蛋白的影响 ） 。

最后我们总结一下研究的研究要素和“套路”：

第一步（ 疾病相关性 ） ：先确定要研究关键的小分子和疾病，这里小分子代谢物的思路对应的是“创新模式”（ 国自然申请| “代谢重编程”研究的“经典”和“创新”模式 ），需要确认小分子代谢物与疾病进展的“临床相关性”；

第二步（ 功能因果关系 ） ：如果是小分子药物或者代谢物，则需要看到小分子药物的作用，这里就需要从体内动物模型和体外细胞层面验证小分子药物或者代谢物对疾病的影响：促进或者改善疾病表型， 这里大家开展研究的时候可以加上一些“热点”，比如细胞衰老、铁代谢、线粒体自噬等等；

第三步（ 初步分子机制 ） ：既然小分子（药物或者代谢物）与疾病和细胞表型有“相关性”和“因果关系”，下面就是探索具体机制了。 不过机制部分我一般分为三部分（三、四和五三步） ，这个初步的分子机制指的是“解释细胞表型的机制”， 一般对应到信号通路和明星指标就行了 ，比如这项研究中发现 10-HAD 抑制软骨细胞衰老，检测后发现细胞衰老有关的明星分子指标 p53 、 p21 和 p16 有改变，那就能说明 10-HAD 通过调控 p53/p21/p16 抑制细胞衰老了；

第四步（ 直接分子机制 ） ：上一步能解释 10-HAD 抑制软骨细胞衰老是通过 p53 、 p21 和 p16 来实现的， 但是没有说 10-HAD 的直接靶点是什么，以及这个直接靶点是如何调控 p53/p21/p16 这些明星分子的。 所以这一步直接作用机制包括三部分：

1) 小分子 10-HAD 的直接靶点 ASPH 的鉴定和验证；

2) 小分子 10-HAD 与直接靶点 ASPH 结合后对靶点的影响是什么？

3) 小分子 10-HAD 与直接靶点 ASPH 结合后，如何调控衰老指标 p53/p21/p16 的？

问题 1 中筛选和鉴定小分子的靶点方法中我们之前说过 DARTS 和 SPR ；

问题 2 则需要确认小分子与直接靶点结合后是影响靶点的稳定性、结构、定位、与其它蛋白的互作，抑或是其它方面？

问题 3 弥补直接靶点 ASPH 与 p53/p21/p16 中间的 Gap 就可以通过蛋白 - 蛋白互作、蛋白 -RNA 互作以及蛋白 - 靶基因 DNA 结合来进一步开展了。

第五步（ 精细位点机制 ） ：这一步要回答的问题是： 小分子与靶点蛋白的具体作用位点 ，对应到本研究中的“ 10-HDA 与 ASPH 的结合具体发生在 ASPH 的 Asp_Arg_Hydrox （ 591-745 ）结构域的糖基化位点”， 这里大家可以用上分子对接、作用位点突变、蛋白的截断实验等策略，并进一步通过 CESTA 、 SPR 等技术进行验证。

好了，大家如果感兴趣，可以联系我们讨论这种思路。