肿瘤的治疗方案从放化疗，分子靶向治疗再到肿瘤免疫疗法，肿瘤治疗的范式和思路发生了根本性的变化，现如今抗肿瘤的新药研发已迈入了免疫治疗时代。现如今国内外上市的肿瘤免疫类抗体已高达9个，包括一个CTLA-4和多个PD1-PDL1阻断剂，也就是免疫检查点抑制剂（Immune checkpoint blockade inhibitors），免疫检查点抑制剂能够解除肿瘤细胞对免疫系统的抑制，使得人体的免疫系统重新攻击并清除肿瘤细胞。
临床的实验数据表明肿瘤免疫检查点抑制剂作单一使用时，其抗肿瘤的应答率只有10-35%，原因在于免疫检查点抑制剂要发挥其抗肿瘤活性的前提条件是人体免疫系统十分健全，细胞毒性T细胞在肿瘤部位有充分的富集，这点在肿瘤病人特别是晚期的肿瘤病人身上是很难达到的。
重新激活人体的免疫系统是下一个新的思路，因此新药研发的前沿领域免疫激活剂将是肿瘤免疫治疗的下一个蓝海！
免疫激活剂的靶点主要集中在B7-CD28家族和TNFR家族，主要包括B7家族的CD28，ICOS受体，TNFR家族的CD27,CD40,GITR,OX40,4-1BB等,针对这些受体靶点的激活剂以抗体为主流，如下图所示目前处于临床阶段的免疫激活剂抗体:
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前处于临床阶段的免疫激活剂抗体
传统的膜受体阻断剂如(PD1/ PDL-1抗体)，游离抗原中和剂（如VEGF抗体，TNFalpha抗体），需要和靶点有较强的亲和力（nM-pM）的结合，一般来讲亲和力和体内药效成正相关。抗体作为膜受体激动剂相对于阻断剂和中和剂要实现其体内的生理功能有着更为复杂的因素，亲和力大小，表位，价态，剂量效应，安全性等都是影响因素，下文将结合文献谈谈这些因素对免疫激活剂研发产生的影响。
Fas（CD95, APO-1, TNFRSF6）是TNFR家族的一员，研究表明其FasL激活Fas能够诱导细胞的凋亡。Chodorge et al等采用噬菌体展示技术对相对于Fas受体亲和力为17nM的抗体克隆E09进行亲和力成熟得到得到更强的亲和力范围在0.35nM-10nM的亚克隆抗体EP12r，EP4b，EP5b，EP6b进行细胞学实验，发现在0.35nM-17nM范围内抗体的亲和力大小和其激活效果（细胞凋亡）成反比，进一步的研究表明抗体的激动剂效果和抗体相对于Fas的解离常数成反比，也就说抗体和Fas解离的更快反而有更好的激动效果。
Chodorge et al对E09克隆和FASL相对于Fas结合，竞争结合，细胞杀伤和晶体结构的分析表明E09克隆，FASL和Fas有不完全相同的结合位点但达到了类似的体外竞争，细胞学活性的检测结果。
价态是单个分子实体相对于靶点分子的结合位点数目，一个完整的抗体IgG是二价的，其结构上有两个抗原的结合位点，IgM是六价的，基础研究表明天然情况下TNF家族受体的激活是以3价态的配体形式和受体相互作用形成有活性的三价复合物。当Chodorge et al将高亲和力弱激活细胞凋亡能力的抗体克隆用Protein A进行偶联提高价态后，各个克隆表现出一致性的显著性提升的激活效果。Young H. Kim et al等采用5价态的GITRL融合蛋白和DTA-1抗体激活GITR在动物肿瘤模型中取得类似的激活效果，维持了30天小鼠无肿瘤状态。Merz C et al等六价态的CD40L在体内动物模型中表现出很好抗肿瘤活性。这些实验结果表明TNF家族的受体激活需要受体以不小于3价态进行超聚。
二价的抗体要形成三价态以上的超聚依赖抗体Fc段FcγR的聚集，这种间接的地使TNFR聚集的方式可能是抗体亲和力不能太强，特别是抗体的解离常数不能太小的原因。
对于一个需要成药的免疫激活剂保证其有效性的同时需要考虑其安全性，过强的激动效果可能会引起安全性风险。CD28激动剂TGN1412在2006年该抗体第一次进入人体临床实验时，6个健康的受试者在注射该抗体的90分钟之内便产生了严重的危及生命安全的细胞因子风暴。开发该抗体的公司TeGenero Immuno Therapeutics也在一年后宣布破产。英国的National Institute for Biological Standards and Control (NIBSC) 关于此抗体的回顾性文章，具体分析该抗体安全性评价的体外测定方法，发现只有在抗体密度非常高或者有内皮细胞的情况下淋巴细胞才有很高的细胞因子的释放，说明了体外的评价方法要达到模拟体内环境的效果需要完善的方法学开发和优化验证过程，从另一个角度来看免疫受体的激活需要其超聚，抗体二价的体外状态在一般条件下无法实现对淋巴细胞免疫受体的超聚激活，对体内的预测可能存在偏差。
恺佧生物“三个火枪手”系列蛋白助力肿瘤免疫激动抗体研发
TNFR家族的靶点激动剂受体的配体是在天然情况下是以三聚态的方式激活TNFR，完成人体内的正常的生理功能，可能会有相对温和的激活效果，三聚态的TNF配体将会是肿瘤免疫治疗激动剂抗体类药物研发过程中很好的阳性对照品来评价体内外生物学活性方法的好坏，区分抗体的亲和力大小，激活效果和安全性的强弱的锚点，类似的比较性文章文献中也有对比研究。
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TNF Superfamily 三聚体结构示意图
抗体药物靶点验证和发现，评价方法先行，恺佧生物提供“三个火枪手”Trimer系列三聚态TNF家族配体可为抗体激动剂研发，蛋白水平表位鉴定的竞争性实验，细胞水平功能方法评价和体内肿瘤模型评价和概念验证提供一个很好的阳性参照，恺佧生物提供的三聚体蛋白与传统的单体设计相比，三聚体设计接近天然，和受体之间有更好的亲和力，和市面上已有的三聚体设计相比，恺佧采用的是单链的三聚体表达，结合更加紧密，不会解离成单体。
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客户应用案例分享：恺佧Trimer LIGHT 在报告基因实验中活性高于竞争对手Monomer LIGHT
免疫激动性抗体需要不同亲和力强度的抗体可供选择以达到合适的细胞学和体内活性，三个火枪手Trimer系列提供三聚态TNF受体系列，在抗体发现的杂交瘤和噬菌体展示应用中将更有可能发现筛选出较弱亲和力的候选抗体，为激动剂抗体后续的功能学实验测定提供更多的亲和力选择区间。
恺佧生物现有三聚态TNF产品：
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参考文献
1.Mayes P A , Hance K W , Axel H . The promise and challenges of immune agonist antibody development in cancer[J]. Nature Reviews Drug Discovery, 2018.
2.Chodorge M , S Züger, Stirnimann C , et al. A series of Fas receptor agonist antibodies that demonstrate an inverse correlation between affinity and potency[J]. Cell death and differentiation, 2012, 19(7):1187-1195.
3.Galon and Bruni. Approaches to treatimmune hot, altered and cold tumourswith combination immunotherapies. Nature Reviews Drug Discovery, https://doi.org/10.1038/s41573-018-0007-y
4.Kim Y H, Su M S, Choi B K, et al. Authentic GITR Signaling Fails To Induce Tumor Regression unless Foxp3+ Regulatory T Cells Are Depleted[J]. Journal of Immunology, 2015, 195(10):4721-9..
5.Merz C , Sykora J , Marschall V , et al. The Hexavalent CD40 Agonist HERA-CD40L Induces T-Cell–mediated Antitumor Immune Response Through Activation of Antigen-presenting Cells[J]. Journla of Immunotherapy, 2018, 41(9):1.
6.Suntharalingam G, Perry M R, Ward S, et al. Cytokine Storm in a Phase 1 Trial of the Anti-CD28 Monoclonal Antibody TGN1412[J]. 新英格兰医药杂志, 2006, 355(10):1018-1028.
关于恺佧生物（Kactus Biosystems）
恺佧生物(KactusBiosystems)是一家以研发为驱动的创新型蛋白抗体国际化生物高科技公司，主要专注于免疫治疗和诊断市场。恺佧生物聚焦于全球创新药研发企业客户，提供基于结构设计的功能靶点蛋白特别是膜蛋白类CRO服务和目录产品。恺佧生物主要创始团队来自于世界一流的企业和研究机构并有多年生物医药行业经验的科学家和商业管理人士。
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