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专家点评 Mol Cell丨王嘉东团队揭示复制叉特异性RNA-DNA杂交链维持转录活跃区基因组稳定性的分子机理

BioArt · 公众号 · 生物 · 2024-12-20 09:05

正文

点评丨袁健（同济大学）

DNA复制过程中复制叉的稳定是维持基因组稳定的重要一环，尤其是在转录活跃区域，DNA复制叉的异常可能导致功能基因突变，进而引发癌症或遗传性疾病。因此，与基因组的其他部分相比，转录活跃区域的DNA复制叉的稳定性对细胞功能的影响更为显著。然而，DNA复制和RNA转录共享同一DNA模板，这可能导致RNA聚合酶的活动干扰复制叉的正常行进，进而引发复制叉停滞。若复制叉未能得到及时的保护，可能会触发转录活跃区域的DNA损伤和基因突变。在转录活跃区这一复杂动态的环境中，细胞如何维持复制叉的稳定性并确保复制过程的高精度，以避免基因突变和癌症的发生，是一个亟待解决的科学挑战。

一些研究揭示了在转录活跃区如何维持复制叉稳定性的机制。一方面，DNA聚合酶在复制叉上的分工合作以及动态调控，有助于在复制应激条件下保持复制叉的稳定性和高保真度的DNA复制。非常重要的另一方面是，复制叉在一些应激响应蛋白和DNA修复因子的帮助下可以发生一系列进程和结构的改变，以维持复制叉和基因组的稳定性。然而，相对于转录非活跃区的DNA损伤修复而言，在转录活跃区容易受到复制压力而停滞的复制叉如何维持稳定性并实现高保真度的DNA复制，仍是一个没有被研究清楚的问题。

2024年12月19日，北京大学医学部王嘉东课题组与王维斌课题组合作在Molecular Cell杂志在线发表了题为DDX39A Resolves Replication Fork-associated RNA-DNA Hybrids to Balance Fork Protection and Cleavage for Genomic Stability Maintenance的研究论文。该研究揭示了复制叉特异的RNA-DNA杂合体（Replication Fork-associated RNA-DNAs，RF-RDs）在转录活跃区域通过抵御核酸外切酶的降解，从而维持转录活跃区复制叉稳定性的作用机制。这项研究首次鉴定出RF-RDs为转录活跃区停滞复制叉的重要保护因子，发现了一条独立于RAD51的复制叉末端保护机制，揭示了转录活跃区基因组稳定性的维持机制，并提出靶向RF-RDs的清除可能是克服肿瘤化疗耐药的有效策略。

研究团队首先开发了“复制叉RNA捕获”（Replication Fork RNA Capture, REFORC）技术，分离复制叉结合的RNA。通过高通量测序分析，他们发现复制压力可以在转录活跃区域诱导产生大量复制叉RNA-DNA杂合体（RF-RDs）。RF-RDs的形成依赖于RNA聚合酶Ⅱ的转录活性，RNA-DNA特异性核酸酶RNase H的处理能够显著减少RF-RDs的水平。这表明RF-RDs是转录活跃区域复制压力响应的重要产物。

随后研究团队研究发现抑制RF-RDs会导致复制叉新生DNA的降解，并显著增加DNA末端切割和DNA断裂的发生。进一步体外生化实验和细胞实验表明，RF-RDs能够抑制核酸酶DNA2的核酸酶活性，从而减缓DNA2对复制叉的降解。研究团队进一步通过全基因组测序发现，在RF-RDs减少的染色质区域，复制压力下会产生更多的基因突变，表明RF-RDs在生理层面具有避免转录活跃区发生基因突变的重要功能。

研究进一步揭示了RF-RDs的形成与解除的动态调控机制。研究团队鉴定了RNA解旋酶DDX39A具有RNA-DNA解旋活性，能够促进RF-RDs的解除。在复制压力下，DDX39A通过RAD51的招募作用，定位于停滞的复制叉，解旋RF-RDs并促进DNA2介导的复制叉重启。缺失DDX39A的细胞不能有效解除RF-RDs，表现出复制叉重启缺陷和自发DNA损伤，完全缺失DDX39A会导致小鼠胚胎致死。

在复制压力早期，RAD51并没有充分结合复制叉，少量的RAD51可以促进复制叉的翻转，同时促进RNA与翻转的复制叉杂交,从而形成RF-RDs，并迅速为复制叉提供抵抗DNA2等核酸酶切割的保护。当RAD51与包被RF-RDs的复制叉充分结合后，一方面可以为复制叉提供保护，另一方面则招募DDX39A解除RF-RDs，并促进DNA2进行有限切割促进复制叉重启，继续完成复制过程。这表明RF-RDs是独立于RAD51的翻转复制叉末端保护机制，发挥转录活跃区复制叉保护功能。

研究还发现，DDX39A低表达会导致BRCA2缺陷细胞的RF-RDs水平升高，复制叉稳定性增强，使BRCA2缺陷肿瘤细胞对化疗产生抗性，进而与BRCA2缺陷肿瘤患者的不良预后相关。重要的是，研究团队还发现铂类耐药肿瘤中RF-RDs的水平较高，通过CDK9抑制剂和BRD4抑制剂可以消除RF-RDs逆转肿瘤化疗耐药，因此靶向清除RF-RDs具有重要的临床转化价值。

该研究揭示了RF-RDs在转录活跃区对复制叉稳定性和肿瘤化疗抗性的关键影响，并阐明了RNA解旋酶DDX39A在调控RF-RDs中的核心作用。这项发现不仅为保持转录活跃区DNA复制叉的稳定性机制提供了新见解，提出RF-RDs为转录活跃区停滞复制叉独立于RAD51的重要保护因子，还为提高铂类药物耐药肿瘤的化疗效果提供了有力的科学依据和干预策略。

北京大学医学部王嘉东教授与王维斌副研究员为论文的共同通讯作者。王嘉东课题组博士后徐战战和博士后聂臣为论文的共同第一作者。王嘉东课题组的博士研究生廖军威，以及麻宇颉博士和周筱博士等人也为该论文做出了重要贡献。

原文链接：

https://www.cell.com/molecular-cell/fulltext/S1097-2765(24)00954-7

专家点评

袁健（同济大学）

基因编码区的复制叉稳定性和DNA复制精确性的维持至关重要，以阻止可能导致灾难性后果的基因突变。然而，虽然细胞最大程度协调复制和转录在不同时空进行，但这一区域不可避免产生转录和复制冲突，易于产生复制压力。揭示如何在这样的复杂环境中确保DNA的精确复制将有助于发现基因突变和疾病发生的深层机制。近期的一些研究工作主要聚焦两个方面回答这一热点和难点问题。一方面聚焦转录如何给复制让路避免TRCs，如通过SOSS-INTAC（Congling Xu et al, Nature, 2023）或Integrator（Rahul Bhowmick et al, Mol Cell, 2023）使RNA Pol-II解离导致转录终止。另一方面聚焦于，面临TRCs时复制叉稳定性如何维持，如RAD51等分子保护复制叉不被核酸酶攻击发生断裂（Wenpeng Liu et al, Science, 2023; Rahul Bhowmick et al, Mol Cell, 2022）。但最近的研究发现在复制发生时转录活跃的Pol II复合体被保留在与DNA接近的位置并迅速恢复转录（Tyler K Fenstermaker et al, Nature, 2023）。而且，Pol II合成的mRNA或TERRA RNA可以促进同源重组修复或保护端粒区基因组稳定性（Jian Ouyang et al, Nature, 2021; Tribhuwan Yadav et al, Mol Cell, 2022）。因此作为造成复制压力来源的转录是否同时对复制叉有正反两方面的影响是一个值得深入探讨的问题。

北京大学王嘉东和王维斌团队建立了分离复制叉新生DNA结合RNA的技术，并结合RNA测序和Dot Blotting发现在转录活跃区域内与复制叉相关的RNA-DNA杂合体（RF-RDs）的普遍存在。RF-RDs在复制应激早期防止DNA2过度切割导致的复制叉崩溃和DNA断裂，清除RF-RDs会导致转录活跃区复制叉崩溃和基因突变。他们的研究提出RNA聚合酶II依赖的RNA-DNA杂交链作为稳定复制叉的另一种新机制，与RAD51一样能够抵御核酸酶对复制叉DNA的攻击，从而防止DNA断裂发生。

该研究团队还通过筛选，发现能特异性解除RF-RDs的RNA解旋酶DDX39A，其在RAD51与包被RF-RDs的复制叉充分结合后，被招募到停滞的复制叉解除RF-RDs，并促进复制叉的重新启动，从而确保DNA复制的连续性。DDX39A过度解除RF-RDs会导致转录活跃区复制叉崩溃和基因组不稳定性。他们还发现在复制应激下RF-RDs的增加增强了复制叉的稳定性，导致化疗抗性，而通过CDK9抑制剂和BRD4抑制剂可以通过消除RF-RDs来逆转肿瘤化疗耐药。

总之，这项研究发现了一个令人兴奋的保证转录活跃区DNA复制精准性的新机制。并提出尽管转录可能增加复制压力和冲突，但它也在某种程度上维持复制叉的稳定性和DNA的准确复制。这不仅有助于我们更好地理解基因组稳定性的维护机制，还可能为逆转肿瘤化疗耐药提供新的策略。

制版人：十一

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