1 背景介绍
蛋白质是生命活动的核心分子，其功能由其三维结构决定。蛋白质的结构可分为四个层次：一级结构（氨基酸序列）、二级结构（α螺旋、β折叠等局部构象）、三级结构（单个多肽链的全局折叠）和四级结构（多亚基的组装）。
例如，酶的催化活性依赖于活性中心的精确三维排布，膜蛋白的信号转导功能与其跨膜结构域的构象变化密切相关。
（图片来源：https://www.rcsb.org/#Category-analyze）
研究蛋白质结构不仅能揭示其作用机制，还为药物设计、疾病治疗和合成生物学提供基础。然而，蛋白质的尺寸通常在纳米级别，传统光学显微镜无法观测，因此需要借助高分辨率技术解析其原子级结构。
X射线晶体学（XRD）
和
冷冻电子显微镜（Cryo-EM）
是当前两种最主流的蛋白质结构解析技术。
2 方法学比较
X射线晶体学的发展始于20世纪初，英国物理学家William Henry Bragg与其子William Lawrence Bragg开创了X射线晶体学领域。他们提出的布拉格定律揭示了X射线与晶体原子排列的定量关系，为物质结构分析奠定了数学基础。
这项技术的影响之深远，正如奥地利化学家马克斯·佩鲁茨所言：“27项诺贝尔奖不可或缺的配方”——截至20世纪末，X射线晶体学直接推动了27项诺贝尔奖的诞生。1953年，英国科学家罗莎琳德·富兰克林（Rosalind Franklin）利用X射线晶体学拍摄了DNA的B型衍射图（“照片51号”）。
图中的“X”形衍射斑直接提示了螺旋结构的对称性——每圈10个碱基对，螺距34 Å。尽管富兰克林因早逝未能获得诺贝尔奖，但她的这份图像帮助詹姆斯·沃森和弗朗西斯·克里克创建了DNA 分子的双螺旋结构模型，成为了生物学发展的一座里程碑。
（“照片51号”；图片来源：https://assassinscreed.fandom.com/zh/wiki）
1958年，科学家在首个成像蛋白质—肌红蛋白内发现了不规则的褶皱，首次利用X射线晶体学解析了其结构，标志着X射线晶体学在蛋白质结构分析领域的重大突破。
该技术的核心原理是利用X射线与蛋白质晶体中原子的相互作用：当X射线穿过高度有序的晶体时，晶格中的原子会使X射线发生衍射，形成特定的衍射图案。
通过分析这些衍射点的位置和强度，结合数学方法（如傅里叶变换），可计算出蛋白质的三维电子密度图，进而构建原子模型。
（图片来源：https://images.app.goo.gl/yfVo1LwXBFu5Dsxq5）
然而，该技术面临两大挑战：蛋白质结晶和相位问题。许多蛋白质（尤其是膜蛋白或柔性蛋白）难以形成高质量晶体。例如，G蛋白偶联受体（GPCR）因跨膜区的不稳定性，直到2004年通过引入抗体片段稳定构象才被成功解析。
相位问题则源于X射线衍射仅能记录振幅信息而丢失相位（波的相对位置），需借助分子置换法或引入重金属原子（如硒代甲硫氨酸）来间接解决。
技术的进步显著提升了X射线晶体学的应用范围。同步辐射光源提供了高强度X射线，使数据采集速度更快、分辨率更高。X射线自由电子激光（XFEL）甚至能捕捉飞秒级动态过程，例如光系统II分解水分子时的瞬时中间态。
冷冻电子显微镜的突破性进展始于2010年代，被称为“分辨率革命”。与X射线晶体学不同，Cryo-EM无需结晶，可直接分析溶液中的蛋白质样品。
其关键步骤包括：将蛋白质样品快速浸入-196℃的液乙烷中，使其在毫秒内冻结成无定形的玻璃态冰，避免冰晶形成（冰晶会挤压样品导致结构畸变）。玻璃态冰中的水分子呈无序状态，包裹生物分子并维持其天然构象。
随后用高能电子束穿透样品并记录散射电子的信号。通过采集数万至数百万张二维投影图像，利用计算机算法（如单颗粒分析）对随机取向的颗粒进行三维重构。
Cryo-EM技术的核心优势在于解析柔性或超大复合体的能力。例如，核糖体和病毒衣壳（如乙肝病毒）的精细结构均通过Cryo-EM得以揭示。
此外，该技术能捕捉同一蛋白的多种构象状态。在新冠病毒研究中，Cryo-EM解析了刺突蛋白的“开放”（结合宿主受体ACE2）和“闭合”（免疫逃逸）构象，为疫苗设计提供了关键依据。
