摘要：
强制降解研究已成为重组单克隆抗体（mAb）治疗药物开发的重要组成部分，服务于从早期可生产性评估到上市前后可比性评价等多种目标。
本文综述了分散在不同监管文件中的指导原则，重点总结了美国食品药品监督管理局（FDA）和欧洲药品管理局（EMA）等机构的期望。
此外，还讨论了强制降解研究的不同目的、常用条件及各条件下的主要降解途径。
强制降解研究的目的
强制降解研究在单克隆抗体治疗药物的整个生命周期中被广泛用于支持多种目标（表1）。监管机构也期望通过强制降解研究理解产品的降解途径，并建立稳定性指示方法以监测保质期内可能发生的降解。此外，强制降解研究常用于评估可生产性、方法开发与验证、关键质量属性（CQA）评价以及产品变体的识别。
常见强制降解条件下的主要降解途径
常用强制降解条件包括高温、冻融、振荡、高pH、低pH、光照、氧化和糖化。这些条件虽严苛于实际储存条件，但可在短时间内生成相关降解产物。主要降解途径总结如图1。
图1. 重组单克隆抗体的主要降解
途径
箭头表示主要降解位点，括号内为常用检测方法。
高温
高温加速多种降解途径，包括聚集（共价或非共价）、肽键断裂（如铰链区裂解）、天冬酰胺（Asn）脱酰胺化、甲硫氨酸氧化等。例如，中性或弱碱性条件下，高温会通过β-消除导致二硫键降解，形成硫醚键交联的不可逆聚集体。
冻融
冻融主要导致聚集体的形成（如二聚体和多聚体），其程度受pH、缓冲液浓度、盐分和蛋白浓度影响。化学降解在此条件下较少发生。
振荡
振荡通过增加抗体与疏水界面（如气液界面）接触，导致共价或非共价聚集。非天然二硫键的形成是共价聚集的主要原因，其程度受pH、盐分、表面活性剂（如聚山梨酯）等因素调控。
低pH
低pH（如纯化过程中的Protein A洗脱条件）诱导聚集、肽键断裂（如铰链区裂解）和天冬氨酸异构化。天冬氨酸异构化会生成中间体琥珀酰亚胺，并导致酸性物种增加。
高pH
高pH条件下，天冬酰胺脱酰胺化（如Fc段的“PNNY”肽段）成为标志性降解途径，同时加速聚集和肽键水解。此外，高pH可能引发二硫键重排，形成硫醚键或游离巯基。
光稳定性
光照主要导致色氨酸、酪氨酸和甲硫氨酸氧化，并引发共价聚集。光氧化具有位点选择性，例如甲硫氨酸氧化倾向于同一重链，而化学氧化则随机分布。
氧化
氧化剂（如过氧化氢）主要导致甲硫氨酸氧化为甲硫氨酸亚砜或砜，其中CH2域的Met252和CH3域的Met428因表面暴露度高而最易被氧化。氧化还可能引发聚集和构象变化。
糖化
糖化是还原糖与抗体赖氨酸侧链或N端氨基的非酶促反应，导致分子量增加162 Da。糖化水平受温度、pH、糖浓度等因素影响，可能影响抗体结合活性或诱导聚集。
强制降解研究的应用
预筛选
预筛选旨在确定能产生有意义降解水平的条件。常用方法包括尺寸排阻色谱（SEC）检测聚集、阳离子交换色谱（CEX）检测电荷变化以及液相色谱-质谱（LC-MS）鉴定氧化或糖化位点。
应用领域
强制降解研究贯穿药物开发生命周期（表3），包括候选分子筛选、配方开发、方法验证、杂质鉴定、可比性评估等。例如，在可比性研究中，强制降解可揭示常规分析无法检测的差异，确保工艺变更后产品质量一致。
监管指导方针
强制降解相关要求分散于多个ICH、FDA和EMA文件中（表4）。例如，ICH Q5C强调需通过极端条件理解降解途径，ICH Q1B规范了光稳定性测试，而ICH Q5E则支持可比性研究中的数据应用。
结论
