干细胞在细胞治疗、组织工程和再生医学以及制药和生物技术应用方面具有巨大前景。它们具有自我更新的能力，并能够根据分离来源分化成特定的细胞类型。然而，干细胞在临床应用中的使用需要高质量和大量的细胞，这需要大规模扩增干细胞。传统的细胞维持和扩增方法依赖于使用平面塑料培养板和异种培养基的2D培养技术，这些方法的扩增有限，细胞在长期传代后往往会失去克隆和分化能力。干细胞的3D扩增新方法强调3D细胞生长以模拟体内环境。本文将简要介绍干细胞3D扩增系统中微载体、生物反应器以及培养基等的上游工艺的最新进展以及策略选择。
微载体的选择
微载体选择是一个重要参数，因为它们的物理和化学特性会影响细胞培养行为。在设计基于微载体的干细胞培养的上游生物工艺策略时，应考虑微载体的不同物理和化学特性，包括尺寸（大、小、微）、孔隙率（无孔、微孔和大孔）、形状（球形、圆柱形和圆盘形）以及表面改性（细胞外基质涂层、化学改性、正或负表面电荷）。未经表面处理和/或涂层的微载体表现出有限的贴壁能力。这可以通过添加功能基团、ECM 或聚合物涂层来修改其表面，以增强细胞附着和细胞存活率。例如Cytodex 1微球是葡聚糖微球，由于包含二乙氨基乙基 (DEAE) 基团而带正电荷，可改善细胞粘附。类似地，微载体也可以使用ECM分子和生长因子覆盖。但一个需要考虑的因素是，目前大多数微载体的涂层材料都是异种的，如胶原蛋白和层粘连蛋白，因存在潜在危险化合物而限制了其在临床级干细胞培养中的应用。一个解决方案是重组ECM类似物。通过在微载体表面加入 ECM 蛋白来改善细胞附着，从而解决细胞贴壁问题，保证未分化细胞的长期扩增。此外，在微载体表面加入生长因子代表了开发可支持干细胞增殖和生长因子递送的治疗性生物活性 微载体的一种新方法。
尺寸和孔隙率是微载体的另一项重要特性，因为它们决定了微载体的表面积和沉降速率，而沉降速率可显著影响细胞的扩增和产量。即使细胞附着不受微载体尺寸影响，该参数也会影响细胞聚集形态，可以探索通过在微载体制造过程中测试不同尺寸来最大限度地增加使用微载体时不同干细胞的数量。就孔隙率而言，微球既可以制成无孔颗粒，也可以制成多孔颗粒。微孔微球（孔隙占总面积的 60% 以下）可增加表面积、细胞粘附和生长。这些微孔微载体特别方便改善灌流系统中的细胞截留。同样，在微孔微载体上培养的细胞可以轻松地从培养基中获取存活和增殖所需的因子。相反，大孔微载体（其中孔隙占总面积的 60% 到 90%）显著减少了细胞附着表面。此外，由于细胞尺寸约为 10 µm，这些微载体允许细胞进入其结构并在其内部生长，从而改善因子和气体的扩散。因此，大孔微载体的主要优点是在使用搅拌或灌流系统时免受剪切应力的影响，以及改善微环境，在使用无血清培养基时增强细胞的活力和生长。
此外，微载体的形状是与沉降速度密切相关的一个参数。低沉降速度（<30 cm/min）会阻碍循环和混合，导致营养和气体供应不足，从而降低细胞活力和产量。研究表明，圆柱形微载体会产生紧凑的细胞-微载体聚集体，而球形微载体会诱导更开放的聚集体结构和更薄的细胞层。最重要的是，细胞扩增和多能性标志物不会因微载体的形状而减少。
尽管很多研究已经通过使用不同的材料、改变尺寸、形状和孔隙率或用不同的材料进行微载体涂层来克服低粘附性和细胞生长的问题，但其中大多数都使用异种材料。在这方面，该领域的主要挑战之一是用当前和新兴的无污染元素取代传统的异种元素。另外，微载体的选择还必须考虑其它因素，例如培养系统，以实现最佳的干细胞工艺。
培养体系的选择
由于通常从天然来源获得的干细胞数量较少，GMP级干细胞培养面临的主要挑战之一是选择最佳扩增系统。该系统必须使用无异种培养基、生长因子和添加物扩增未分化状态的干细胞。3D生物反应器是克服静态培养限制的可行选择，因为它们提供了一个可放大的系统，其中可以监控和控制操作因素。
关于培养系统的首要选择要素是生物反应器的类型，必须考虑扩增细胞的最终应用。例如，搅拌罐生物反应器是相对简单的培养系统，由一个带有搅拌桨的容器组成，搅拌桨搅拌内部物质以提供均匀的培养液。此类培养系统已成功测试了在无异种条件下扩增不同类型的干细胞，包括间充质干细胞 (MSC)、诱导性多能干细胞 (iPSC) 和胚胎干细胞（ESC）。使用这些系统时需要关注产生的剪切应力，可能会损坏对剪切敏感的细胞，通过控制搅拌桨的形状和搅拌速度，可以最大限度地减少这一问题。
该类生物反应器系统中必须监测和控制的另一个重要参数是氧饱和度。在不同 O2浓度下培养的干细胞可能在细胞增殖、活力和分化能力方面表现出显著差异。一些研究测试了在低氧饱和度（约 5%）下培养iPSC和 ESC，在缺氧条件下观察到细胞从有氧到无氧途径的显著代谢变化。但这种情况导致乳酸浓度升高，培养基的 pH 值从中性变为酸性。当在 ESC培养中使用 30% 的氧饱和度时，实现了更高的代谢和细胞生长率。
生物反应器的设计对于临床级干细胞的扩增至关重要，并且必须完全符合GMP法规，而生物反应器容器特性（例如材料、尺寸和形状）是影响细胞生产并最终影响生物工艺成本的关键参数。生物反应器的材料和设计应便于清洁和生产步骤，从而防止任何污染的可能性。在这方面，一些生物反应器系统已经开发出使用一次性装置作为避免清洁过程和降低污染风险的新策略。
上述系统可以与微载体结合，从而将系统的特性与其融合在一起，所以，未来的趋势可能集中在探索这些具有不同微载体特性的生物反应器系统，以针对特定的干细胞类型，最大限度地提高细胞产量，同时保持其活力和多能性。
培养基和添加物
维持和扩增干细胞所需的培养基、生长因子、细胞因子和其它添加物是上游生物工艺中的关键元素。培养基配方中包含异种或未定义的化合物以及对细胞功能所涉及的多种分子和细胞机制的不理解是需要解决的主要问题。培养基和添加物中的异种成分具有潜在危险，因为它们可能含有可传播给培养细胞的致病因子，从而阻碍其用于医疗应用。例如，胎牛血清 (FBS) 是一种低分子量和高分子量生物分子的异种复合混合物，传统上被包含在培养基配方中以促进细胞生长。然而，众所周知，它们的生产批次间含量存在显著差异，从而改变了生物分子的批次间浓度和工艺的可重复性。这在GMP级干细胞培养中必须完全避免，因为它可能含有不良因素，如：内毒素、支原体、病毒污染物和朊病毒蛋白。
干细胞培养配方中经常添加促进未分化状态细胞增殖的细胞因子和生长因子。这些添加物通常来自异种来源，因此它们在临床干细胞培养中的使用也受到阻碍。但目前已经有很多无异种材料的开发和干细胞培养的应用，而有关使用无异种培养基的报道已证实了细胞的扩增能力及其在整个培养过程中保持分化潜能的能力。
细胞分离
细胞与微载体分离是直接影响细胞活力的重要步骤。目前，已经开发了不同的分离策略，这些策略与基于微载体的生物工艺完全兼容。其中，基于蛋白水解酶的方法最为常用。传统上，胰腺衍生的牛和猪胰蛋白酶是广泛用于细胞分离的酶。尽管这些酶很有效，但它们的动物来源使其无法用于医疗环境，必须探索无异种替代品。重组胰蛋白酶样酶，如 TrypLE 和 TrypZean是解决胰蛋白酶使用不便的办法。虽然这些酶在不同的生物体中表达，但它们在不同的比较研究中表现出与胰蛋白酶相似的干细胞分离活性。
