Plus深读 | SETD7控制心肌各时期的发育

SETD7，即KMT7，传统意义上功能是催化H3K4的单甲基化(1)。有趣的是，有关SETD7催化组蛋白甲基化的功能研究不是主流。SETD7更倾向于结合在松散的组蛋白上而不是紧密的核小体内的组蛋白上，且能够结合一系列重要核蛋白并调控其功能，比如p53、TAF10、YAP、ERa、SOX2、E2F1、HIF1a、Lin28a等，比如结合并甲基化修饰p53 (1)、YAP (2)等蛋白，促进其稳定性。

本文研究者发现，SETD7在心肌发育的不同时期、和基因序列的不同位置，分别结合不同蛋白起到调控作用：启动子区域分别结合还P300、BAF60a和BRG1，以及NKX2-5；基因编码区则能结合gene body上的甲基化修饰的H3K36，参与到H3K36甲基化介导的激活形态Pol II结合作用，共同影响后续的靶基因转录调控的过程中。

1：心肌细胞分化过程中SETD7水平上升

心肌细胞分化过程：

首先发现SETD7在心肌细胞分化过程中逐渐升高（Fig.1A-E）。以CMs标志TNNT2为参照，发现所有的TNNT2阳性细胞中SETD7都在核中有强表达。

四个时期样本分别进行SETD7 ChIP-seq、RNA-seq，分析SETD7的结合位点，则发现既能结合在promoter、又可以结合在gene body区（Fig.1H-I）；根据其变化趋势可将基因分成5组（Fig.1G）。GO分析发现cluster 4主要是mesoderm specific（中胚层相关）基因，而5则偏重于更后期的心脏发育和成熟相关基因（Fig.1J-L）。

Figure 1

2：SETD7敲除会导致心脏发育异常

研究者构建了SETD7-/-细胞（Fig.2A），并用心肌发育关键转录因子NKX2-5接GFP作为reporter，发现SETD7敲除导致NKX2-5表达降低，其他关键蛋白减少（Fig.2B-C）。shRNA也得到同样的结论（Fig.2D-G），都证明SETD7在心肌分化中是不可缺少的。

Figure 2

3：SETD7能够调控中胚层关键因子的表达

Mesoderm lineage genes: T, EVX1, DKK1, MIXL1, EOMES, NODAL, MESP1

cardiac TFs: NKX2-5, TBX5, GATA4

在SETD7降低时水平都会下降（Fig.3A-B）；回补SETD7蛋白，这些关键基因也跟着上调（Fig.3C-D）。更有力的证据是，制作embryoid bodies (EBs)即拟胚体，发现SETD7缺失后内-中胚层相关基因水平下降，而外胚层上升（Fig.3E-F）。

并且SETD7的缺失对发育时间要求不严格，即使在发育到D3-5时敲低，仍旧保有抑制分化的能力（Fig.3G-I）

Figure 3

4：SETD2能够调控中胚层关键蛋白的转录，也能与心肌发育关键转录因子NKX2-5相互调控

研究者首先证明，在中胚层lineage细胞中SETD7和p300、BRG1、BAF60a等SWI/SNF关键蛋白也存在相互结合（Fig.4A）。Figure 4B显示，以上蛋白都能够直接结合到关键蛋白的DNA序列上；并且针对promoter区域设计ChIP-PCR引物，发现SETD7的缺失能够影响p300和BRG1与序列的结合。

进一步证明，SETD7与心肌发育关键转录因子NKX2-5存在相互作用，并且能够结合相同的promoter：MYH6和NKX2-5（Fig.4C-E）。更有趣的是，不仅SETD7和NKX2-5能够结合NKX2-5的promoter，NKX2-5还能反过来结合SETD7的promoter（Fig.4F-G），并且敲低后都能影响对方的表达水平（Fig.4H），进而影响结合下游DNA区段的能力（Fig.4I）。

Figure 4

5：SETD7的突变不会影响H3K4me1的水平，但能结合H3K36me3

SETD7甲基转移酶酶活区域的抑制剂PFI-2不能影响心肌细胞发育相关关键蛋白的水平（Fig.5A-B,D），并且PFI-2以及SETD7的缺失都不能影响H3K4me1的总体水平（Fig.5A,C），证明SETD7在心肌发育过程中的功能可能并不依赖于其组蛋白甲基化功能。

为了全面分析组蛋白修饰与SETD7之间的关系，研究者将抑制性和激活性的修饰分别进行ChIP-seq来与SETD7比较，发现激活性的与SETD7分布更类似（Fig.5E）。进一步证明了SETD7能结合H3K36me3（Fig.5F-H）。通过ChIP分析还发现，SETD7与H3K36me3之间存在共同的结合位置和结合pattern（Fig.5I-K）。

Figure 5

6：SETD7不能催化H3K36me3，但是能够影响活化Pol II的结合、影响下游基因转录

虽然发现SETD7与H3K36me3在调控上的一致，但体内和体外实验都发现SETD7并没有催化H3K36me3的功能，仍旧只能催化H3K4me（Fig.6A-B），并且SETD7的缺失也不会影响H3K36me3的结合（Fig.6C-E）。H3K36me3的甲基化酶SETD2的缺失不仅能够降低H3K36me3水平，同时能够降低SETD7结合，说明SETD7的结合需要H3K36被三甲基化作为基础（Fig.6F-G）。然而SETD7的缺失能够影响活化的Pol II对序列的结合，特别是TES附近（Fig.6H-k），这暗示着其能够影响靶基因转录。

Figure 6

7：SETD7能够调控mature CMs中的钙流，影响跳动

SETD7在成体心肌细胞中也有高表达（Fig.7A-C）。在成熟心肌细胞中敲除SETD7后，细胞增殖、凋亡都未受到影响(Fig.D-F)，但是功能受损，表现为跳动异常（Fig.G-J），connexin 43定位异常（Fig.I），以及钙流异常（Fig.K-Q）。研究者在测序结果中寻找到两个与钙水平相关的基因，即CASQ2功能是保持SR（sarcoplasmic reticulum）中钙的存储，RYR2则能促进SR释放钙。其中CASQ2能够被SETD7结合调控表达，SETD7突变后CASQ2减少而RYR2升高，导致钙储存紊乱。

Figure 7

原文链接：

http://pmo347760.pic31.websiteonline.cn/upload/2018-SETD7DrivesCardiacLineageCommitmentthroughStage-SpecificTranscriptionalActivation.pdf

本文来源

Jaecheol Lee et al. (2018). Purification and functional characterization of a histone H3-lysine 4-specific methyltransferase. Cell Stem Cell 22, 428–444.

Reference

1. Wang, H., Cao, R., Xia, L., Erdjument-Bromage, H., Borchers, C., Tempst, P., and Zhang, Y. (2001). Purification and functional characterization of a histone H3-lysine 4-specific methyltransferase. Mol. Cell 8, 1207–1217.

2. Chuikov, S., Kurash, J.K., Wilson, J.R., Xiao, B., Justin, N., Ivanov, G.S., McKinney, K., Tempst, P., Prives, C., Gamblin, S.J., et al. (2004). Regulation of p53 activity through lysine methylation. Nature 432, 353–360.

3. Oudhoff, M.J., Freeman, S.A., Couzens, A.L., Antignano, F., Kuznetsova, E., Min, P.H., Northrop, J.P., Lehnertz, B., Barsyte-Lovejoy, D., Vedadi, M., et al. (2013). Control of the hippo pathway by Set7-dependent methylation of Yap. Dev. Cell 26, 188–194.