RNA干扰(RNAi)疗法
的发展始于1998年发表在Nature杂志上的一篇题为“Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA
in Caenorhabditis elegans”重要论文。Andrew Fire、Craig C. Mello等科学家发现，使用长双链RNA
(dsRNA)能够沉默秀丽隐杆线虫中特定基因的表达。
在该研究的基础上，Thomas Tuschl等在2001年发表的另一篇Nature论文中揭示，使用
小干扰RNA
(small-interfering RNAs,
siRNA
s)在哺乳动物细胞中实现了序列特异性RNAi，且不会诱导使用长双链RNA (dsRNA)引发的免疫反应。基于这些重要发现，siRNA在科研及治疗领域的应用开始发展。
与单链反义寡核苷酸(antisense oligonucleotides，ASO)不同，siRNA是短的双链RNA
(dsRNA)，由一条与靶RNA具有相同序列的正义链，及一条互补引导(反义)链组成。在被细胞摄取后，siRNA与
RNA诱导沉默复合物
（
RISC
，
一个由AGO2内切酶、反式激活应答RNA结合蛋白2和DICER1组成的多蛋白系统
）相互作用，正义链被清除，引导链（反义链）充当识别靶序列的模板，介导互补靶mRNA的结合及降解，从而终止靶蛋白的翻译。
反义寡核苷酸(ASO)是首个获监管部门批准的寡核苷酸药物，合成ASO可以被设计成靶向剪接信号序列并调节pre-mRNA剪接(图1a)，也可以被设计成结合靶mRNA中的互补序列，并招募核糖核酸酶H1 (RNase H1)以降解靶mRNA(图1b)。外源性siRNA是内源性miRNA的“表亲”，利用siRNA诱导沉默复合物（siRISC）介导基因沉默(图1c)。miRNA利用miRNA诱导沉默复合物(miRISC)通过使mRNA脱帽或缩短poly(A)尾巴介导基因沉默（图1d）。（来源：Nature
Biotechnology）
目前，全球已有6款RNAi药物获批上市，验证了RNAi疗法在人类中的应用。随着RNAi不断取得治疗突破，该赛道的产业热度也在急剧上升。2023年以来，制药巨头BD之风也吹到了RNAi领域，罗氏牵手Alnylam
（潜在交易总额28亿美元）
、BI牵手瑞博生物
（潜在交易总额超20亿美元）
、诺华牵手舶望制药
（潜在交易总额41.65亿美元）
……MNC已毫不掩饰对RNAi疗法的兴趣。此外，从管线来看，医药魔方NextPharma®数据库显示，截至2024年7月26日，全球有超620个RNAi项目同步在研。
RNAi疗法具有特异性沉默几乎任何治疗靶点的潜力。然而，将这类创新性疗法带给更多患者仍面临巨大的挑战，其中递送问题最为突出。
过去几年，
RNAi疗法
递送技术进展如何？RNAi疗法的靶点选择有何讲究？临床开发有哪些注意点？未来的优势发展方向在哪？
近日，来自University of
Massachusetts Chan Medical School的两位科学家在Nature Reviews Drug Discovery 杂志发表一篇综述文章，就以上问题展开了深入探讨。
来源：
Nature Reviews Drug Discovery
siRNA向靶组织或细胞类型的功能性递送受到多种因素的影响，包括给药途径、生物屏障、外渗、组织或细胞摄取和内体逃逸。目前获批用于递送siRNA的技术包括LNP和基于GalNAc的偶联技术（肝脏递送）。其中，偶联介导的递送是目前临床上递送siRNA的主要平台。在LNP和GalNAc介导肝脏递送取得成功后，目前适合递送的组织正在扩大。其中，中枢神经系统(CNS)、眼睛、肺、肌肉和皮肤递送显示出可喜的进展，其他组织（包括肾脏、心脏、脂肪、胎盘和胰腺等）的递送也正在积极探索中。这些进步主要归因于最近递送平台和给药模式的创新。例如，通过局部给药（local administration）可将siRNA选择性递送至中枢神经系统（CNS）、眼睛、肺和皮肤；通过系统递送（systemic delivery）可以使siRNA到达肌肉、肾脏、心脏、脂肪、胎盘和胰腺，虽然这种方法没有选择性，但siRNA在可接受的剂量水平下会优先在这些组织中的某些细胞类型中积累。
在不同组织中实现治疗性RNAi递送的技术
来源：
Nature Reviews Drug Discovery
GalNAc偶联siRNA结合细胞表面去唾液酸糖蛋白受体（ASGPR），通过内吞作用，促进肝细胞摄取。已获批上市的6款RNAi疗法有5款使用了GalNAc系统。GalNAc介导的肝细胞递送是一种独特的情况，肝脏的天然过滤功能、高血流量、开窗内皮以及ASGPR的快速循环共同导致了强大的疗效和持久性。目前，一些靶向偶联物，包括抗体、工程蛋白、肽、适体和脂质，正在开发用于siRNA肝外递送(图2a)。
改变药代动力学特征以改善siRNA全身分布和促进肝外疗效的策略（来源：Nature
Reviews Drug Discovery ）
siRNA向非肝组织的系统递送在概念上是复杂的，需要更好地理解驱动清除和生物分布的原理。siRNA的生物分布可能受到给药途径、核酸酶稳定性和清除器官生理特性的影响。肝脏和肾脏是系统注射siRNA的主要清除器。肝脏较高的血流速率、不连续的内皮以及肾脏的天然过滤功能会在达到充足的系统积累之前就清除大部分注入的化合物。
一般来说，骨架（scaffold）的整体亲疏水比决定了siRNA的清除模式。高疏水性siRNA在肝脏中被清除较多，高亲水性siRNA在肾脏中被过滤较多。事实上，与肌肉和中枢神经系统等组织(通常1–2 μg g−1就足够了)相比，
肾脏
中的靶向沉默需要高近两个数量级的siRNA积累(>100 μg g−1)。因此，对于肾脏，需要额外的化学改造，如增强稳定性和内体逃逸，以提高疗效。肾脏是许多肾脏疾病的重要器官，siRNA成功递送到肾小球内皮细胞和足细胞等细胞类型，将开启前所未有的机会。
有研究显示，
脂质偶联物
（如docosanoic acid，phosphocholine (PC)–DCA）能够显著改善了siRNA的系统分布，在包括肌肉、心脏和脂肪在内的几种肝外组织中显示出疗效。除了表现出更好的肝外摄取外，这类化合物还显出更好的安全性。一项治疗先兆子痫的I期临床试验正在评估PC–DCA偶联siRNA对sFLT1的调节作用。此外，2′-O-hexadecyl (C16)脂质偶联siRNA正在临床前和临床研究中被广泛评估。
显示出强大系统肝外效用的
其他类型偶联物包括抗体、抗体片段和工程蛋白
。这类偶联同时显著增加了siRNA药物的总体大小，从而通过降低肾脏清除率促进系统分布。
抗体
偶联siRNA进展最快的是使用靶向转铁蛋白受体1 (TfR1)的单抗，可用于骨骼、心脏和平滑肌递送。在一项临床前研究中，靶向SSB
mRNA(编码小RNA结合外切酶保护因子La)，单次静脉注射6 mg kg - 1剂量的anti-TfR1–siRNA偶联物导致高达75%的靶点下调。一项针对人类患者的I/II期研究表明，使用anti-TfR1–siRNA靶向肌张力蛋白激酶(DMPK)治疗1型强直性肌营养不良，可显著改善疾病预后。
Centyrins是一类小的，工程化的
人类蛋白质衍生物
，也被用于siRNA肝外递送。centyrin-siRNA偶联平台显示出有希望的系统递送特性。一项使用centycin -conjugated siRNA (ABX1100)用于肌肉递送，以沉默糖原合成酶1 (GYS1)基因以治疗庞贝病的I期试验正在进行中。
肽
偶联也有望发展为siRNA的递送平台。肽可以合成，因此CMC相对不那么复杂。胰高血糖素样肽1（GLP1)是GLP1受体的一种配体，已被成功地用于将ASO递送到胰岛细胞。许多学术实验室和制药公司正在进一步探索肽偶联作为一种有前途的siRNA递送策略的潜力。
适配体
是第一批被探索用于递送siRNA和其他寡核苷酸疗法的偶联物之一，但可能由于早期的一些尝试观察到的持久性有限，目前还没有在转化领域获得太多的关注。不过，最近适配体在疾病动物模型中取得了显著进展，特别是靶向肿瘤相关的某些生物标志物，因此具有临床转化的潜力。
另一种改善系统递送的策略是使用
纳米结
构
（nanoconstruct）作为siRNA的载体。不过，某些包含大量siRNA的高载荷设计可能会触发不希望的免疫反应。因此，为了更好地利用纳米结构递送siRNA，需要增强对如何避免潜在免疫原性和改善有效载荷释放的理解。
经优化的siRNA局部给药到中枢神经系统、眼睛、肺和皮肤已显示出强大的疗效。将化合物直接递送到这些相对封闭或易于进入的组织中，可以增强滞留，并确保化合物的充足供应以供细胞摄取。如前文所述，siRNA的分子性质（如疏水性、分子大小）也能够降低清除，并促进摄取。举例来说，偶联C16脂质链到siRNA正义链上可以在啮齿动物和非人灵长类动物(NHPs)的中枢神经系统、眼睛和肺中实现安全、有效和数月的沉默。此外，当siRNA进行局部给药时，可以测试多种优化骨架结构的设计，不同的骨架可以产生不同的细胞类型摄取谱。
siRNA局部递送（来源：Nature
Reviews Drug Discovery ）
通过直接注射到脑区或注入脑脊液(CSF)，将siRNA治疗药物递送到中枢神经系统是可行的。给药方案是向中枢神经系统递送siRNA的重要考虑因素。将二价siRNA注射到脑脊液中支持广泛分布：在脑脊液高暴露区域(如海马体、丘脑、皮质和脊髓)积累水平高，而在更深区域(如尾状核和壳核)积累水平较低。因此，CSF注射治疗性siRNA可能适用于治疗累及皮质、海马体和脊髓的神经退行性疾病，如肌萎缩侧索硬化症和阿尔茨海默病。
皮肤是siRNA局部递送最大和最容易接近的人体组织。但局部递送大分子（如siRNA）穿过皮肤屏障的最外层(即角质层)是具有挑战性的。皮内注射是一种可行的siRNA递送方法，在临床上通常用于局部皮肤病适应症的治疗。疏水偶联物可以显著改善局部注射后siRNA在皮肤中的滞留。未来的研究重点包括在猪模型（更接近人类皮肤）中测试不断优化的siRNA平台的皮内注射效果，以促进临床转化。
将siRNA递送到离体器官用于移植是一个潜在的令人兴奋的应用。机器灌注递送siRNA沉默参与缺血再灌注损伤的基因有助于保持移植器官的质量。递送沉默免疫因子的siRNA可能有助于减少快速的移植排斥反应。这绝对是一个值得关注的领域。
siRNA药物的开发与传统的小分子和生物制剂有很大的不同，主要区别在于siRNA的PK特性和靶向特异性可以独立优化：PK特性由整体化学骨架和偶联定义，而靶向特异性主要由向导链序列定义(图2a)。值得注意的是，平均而言，siRNA候选药物的设计和开发走向临床验证的成功率大大高于传统管道的成功率，但依然有一些关键因素需要重视：
RNAi药物开发的临床适应症和靶点选择（来源：Nature Reviews Drug Discovery ）
成功开发用于某一临床适应症的siRNA药物需要选择相关靶点。考虑靶点选择的基本因素是将siRNA递送到靶组织的能力（具有强大的有效性和可接受的安全性）。如前所述，当前肝脏递送已经经过充分验证，中枢神经系统、肺、眼睛、肌肉和皮肤递送也有可靠的动物数据。第二个关键因素是了解递送系统的分布。举例来说，大多数肌肉靶向偶联物也会递送到心脏和肝脏病诱导靶点沉默。因此，对于治疗应用，开发人员应确保靶点优先在预期组织中表达，或者off-tissue调控是良性的。
此外，需要注意的一点是，如果某个疾病的靶点过度上调，那可能会超过RNAi机制的能力。一个替代策略是靶向与该靶点相互作用的上游信号因子。另一个方法是，使用多靶向siRNA再额外靶向其它靶点，或者联合其它药物类型实现协同效应。同时，靶点选择还需要考虑mRNA
turnover率对siRNA药效的影响。研究表明，高turnover率的mRNA更能抵抗RNAi介导的沉默。
靶点表达细胞类型的增殖速率也会显著影响siRNA的效力和持久性。随着时间的推移，快速分裂的细胞会稀释内化siRNA的细胞浓度。因此，活跃分裂细胞（例如肿瘤细胞和表皮角质形成细胞）中的RNAi活性可能会降低，需要重复给药以维持沉默效果。相比之下，siRNA的持久性通常在非分裂状态的细胞类型中持续更长时间，比如神经元。
另一个重要的考虑因素是临床有效性。在很长一段时间里，人们认为siRNA不能与小分子和生物制剂竞争，因此，没有考虑已经有有效药物的靶点。然而，一年两次或一年一次给药频率的潜力，支持实际的便利性和患者依从性，现在使siRNA成为一种非常有吸引力的替代modality。最明显的例子是inclisiran，它靶向PCSK9，降低失调的胆固醇水平，尽管市场上已经有几种获批的生物制剂。
为了避免off-tissue沉默带来的潜在副作用，一个有用的策略是关注在siRNA递送组织中优先表达的治疗靶点。例如，由MSTN编码的myostatin是一种主要在骨骼肌中产生的肌肉因子，作用于肌细胞抑制肌肉生长。靶向调节myostatin可能对治疗肌肉萎缩症有益。在跨多个组织普遍表达基因的情况下，系统靶向需要通过安全性研究进行仔细评估，因为off-tissue靶向沉默可能会带来潜在的风险。
先导化合物优化是连接体外筛选和体内验证的关键步骤。骨架和核苷酸修饰能够显著影响siRNA活性，因此优化过程中的任何重大变化都必须进行测试，以与亲本化合物进行活性比较。先导化合物的优化重点是改善体内递送、效力和持久性。先导化合物应仔细纯化和做好质量控制。在进行全面的临床前安全性和有效性研究之前，对优化的先导化合物物进行快速体内验证以确认靶点沉默情况将有所帮助。
理想情况下，先导化合物的疗效应在相关疾病模型中进行评估。然而，许多人类疾病缺乏动物模型，或者相关模型可用性有限，带了较大挑战。此外，动物模型的相关性——也就是说，它是否准确地反映了人类疾病的特征——是至关重要的，特别是对于炎症性疾病和癌症，这些疾病的确切原因可能是未知的。对于其他疾病，如亨廷顿病和肌强直性营养不良，其潜在机制在遗传水平上得到明确定义，因此，siRNA的设计和临床前评估更加“有利”，特别是当建立了人源化转基因模型时。
尽管siRNA在啮齿类动物和NHP中具有良好的临床前安全性，但在临床验证中仍可能存在不确定性，如在revusiran的III期试验中所见，该试验导致了意外死亡率。尽管进行了广泛的调查，但确切原因仍不清楚，这强调了siRNA药物开发的所有阶段都需要进行彻底的安全性评估。
值得注意的是，siRNA药物先导化合物的鉴定和临床前开发的时间较短，这一特点支持针对罕见遗传疾病或对现有治疗无响应的晚期癌症个体化患者开展临床试验的高可行性。这些N-of-1研究（一种基于单个病例进行的随机对照试验）为siRNA药物的快速临床验证和开发提供了绝佳的机会。
与传统药物相比，siRNA具有明显的优势，包括它们能够沉默以前被认为不可成药的靶点，开发时间更短，临床持久性更长等。未来，这类药物形式在以下几个领域极具前景：
siRNA药物极具前景的未来应用方向（来源：Nature Reviews Drug Discovery ）
