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专家点评Cell Stem Cell丨王凯/王茜/孔炜/谢正伟合作开发iPSC衍生静脉内皮细胞用于血管畸形新模型的构建和药物筛选

BioArt · 公众号 · 生物 · 2024-11-25 08:28

正文

静脉畸形 (Venous malformations, VM) 是由静脉内皮细胞（VECs）内的体细胞突变导致的最常见的血管畸形，发病率为万分之一到万分之二。【1】静脉畸形的典型症状为血管结构异常、患病部位疼痛、肿胀和出血以及器官功能障碍【2-3】。目前常用的治疗方法包括硬化治疗和手术切除等，虽能有效控制但也面临不能彻底治愈，费用昂贵以及较高的手术风险等问题【4】。而针对VM的药物治疗方案仍有很大空白，目前尚未有FDA批准药物的一个主要原因是缺乏能复现疾病症状，成本可控且容易大规模复制的疾病模型。VM的致病性体细胞突变通常不可遗传且局部发病，所以涉及转基因动物育种的传统方法并不适用。此外，利用AAV病毒等手段在小鼠模型中递送突变体的方式，虽能呈现血管畸形的表型，但也存在着高成本，稳定性低和人鼠差异的缺点。因而，开发一种全新的血管畸形模型，对于血管畸形的病理机制研究和相关的药物开发有着重要意义。

2024年11月21日，北京大学基础医学院血管稳态与重构全国重点实验室的王凯研究员和孔炜教授，与北京大学第三医院临床干细胞研究中心的王茜研究员以及北京大学国际癌症研究院的谢正伟研究员团队合作在Cell Stem Cell期刊上发表题为Generation of iPSC-derived human venous endothelial cells for the modeling of vascular malformations and drug discovery的研究论文，开发了一种高效的静脉内皮细胞（iVEC）分化方案，进一步利用携带TIE2-L914F杂合突变的iPSC衍生的iVEC 复现了静脉畸形的病理特征，利用AI辅助的药物预测结合Drug-seq，发现FDA批准原本用于治疗白血病的药物博舒替尼（Bosutinib），能有效地改善血管畸形的表型，具有临床应用的潜力。

该研究聚焦VMs最常见的致病突变TIE2 p.L914F (c.2740 C>T)。TIE2 (TEK) 是受体酪氨酸激酶亚家族成员，主要表达于内皮细胞，在血管生成、重塑、成熟和完整性方面发挥重要作用。目前模拟血管畸形最广泛使用的细胞模型是 HUVECs 过表达的突变体。然而该类模型存在明显的失真问题。一方面是体外扩增的 HUVECs失去了部分静脉特性，另一方面是过表达产生的突变体剂量必然多于患者体内的杂合突变。为更好地模拟静脉的特性，研究团队开发了一个稳健的静脉内皮（iVECs）分化方案。该方案涉及调节视黄酸信号通路以调控细胞周期，从而促进向静脉内皮的特异性分化。针对突变拷贝数问题，团队利用基因编辑技术向iPSCs的TIE2基因中引入了L914F杂合点突变。

研究者在前人研究的基础上，通过对分化条件的不断调整，确定了以血管内皮生长因子VEGFA, 成纤维生长因子FGF2, NOTCH抑制剂DAPT和视黄酸（RA）为主要成分的稳定而高效的静脉内皮分化方案。进一步研究明确了其中的RA能够促使G1早期阻滞，从而促进向静脉谱系的分化。iVECs和iAECs的单细胞测序数据比对结果表明，MEF2C可能促进静脉内皮的分化。而该基因以往并没有被报道过在动静脉内皮的异向分化过程中起直接作用。基于此，研究人员过表达了MEF2C基因，发现静脉内皮细胞比例有所提高。对于iVECs进行功能验证证明其具有静脉特征，包括一氧化氮生成水平低、剪切应力响应弱、招募免疫细胞能力增强等。体内移植的iVECs同样能持续表达静脉标记物，且形成可灌注的管腔。

随后，研究者使用CRISPR-Cas9向iPSCs中引入了TIE2-L914F杂合突变。突变的iVECs复现了VM的病理表型，包括F-actin紊乱、增殖能力与抗凋亡能力增强、成管腔能力减弱。Bulk RNA-seq支持了突变型VM中相应通路和基因表达水平的异常。进一步将突变型iVECs移植到小鼠肾包囊下，形成了畸形血管并产生显著的功能异常。为了寻找到合适的VM治疗药物，团队使用了基于深度学习的DLEPS方法进行了药物预测。结合DRUG-Seq，团队推测博舒替尼是一种潜在的可用药物。向突变组给药后，其VM异常表型得到显著改善，证明了博舒替尼的治疗作用。进一步探究给药组的基因组表达及蛋白组表达情况发现，博舒替尼通过减弱突变组内皮间质转化水平而抑制细胞增殖，进而缓解了TIE2-L914F突变导致的异常表型。

综上，该研究发现视黄酸RA介导的细胞G1期阻滞并激活祖细胞向静脉内皮细胞转化所需的基因。作者在iPSCs中引入L914F杂合突变并分化为静脉内皮作为静脉畸形模型，利用深度学习和高通量DRUG-Seq方法鉴定出Bosutinib在体外和体内有效地挽救了疾病表型，为血管畸形领域潜在药物研发和临床治疗靶点提供了更多的可能。

北京大学基础医学院生理学与病理生理学系博士研究生潘子航和姚启扬为本文的共同第一作者，北京大学基础医学院生理学与病理生理学系的王凯研究员和孔炜教授、北京大学第三医院临床干细胞研究中心的王茜研究员和北京大学国际癌症研究院的谢正伟研究员为本文的共同通讯作者。

课题组网站：https://www.x-mol.com/groups/kai_wang_pku 诚邀志趣相投的本科生、研究生和博士后的加盟。

专家点评

林晓曦（上海交通大学医学院附属第九人民医院）

传统的静脉畸形模型一般通过在人脐静脉内皮细胞（Human Umbilical Vein Endothelial Cells, HUVECs）中过表达突变基因来表现静脉内皮的异常，但其存在突变拷贝数过多以及细胞传代后丢失静脉表型等问题。因而准确模拟疾病的致病突变并能大量获得类似于静脉畸形病灶中的内皮细胞是该类疾病研究建模中迫切需要的。北京大学王凯研究员牵头的研究团队利用基因编辑技术，在人诱导多能干细胞（iPSCs）中引入了经典的TIE2-L914F杂合致病点突变，并成功分化为静脉内皮细胞，从而在体内和体外建立了高度模拟静脉畸形的疾病模型。这一模型的建立填补了干细胞用于静脉畸形研究领域的空白，为血管畸形的研究增加了一种新的疾病模型，为后续的药物筛选和机制研究提供了重要平台。通过深度学习和AI增强的高通量药物筛选，研究团队发现了博舒替尼 (FDA批准用于白血病的治疗) 对静脉畸形的潜在治疗作用，这一研究成果不仅具有理论价值，更有望为静脉畸形的患者带来新的治疗选择。

专家点评

王强（华南理工大学）

目前文献报导的干细胞衍生内皮细胞多为异质性强的“泛内皮细胞”，除了表达内皮细胞的特征标志物，还兼具静脉内皮细胞及动脉内皮细胞的标志物。北京大学王凯研究员牵头的研究团队发现通过调节视黄酸信号通路，通过调控细胞周期，成功实现了血管祖细胞向静脉内皮细胞的特异性分化。通过单细胞测序技术，该研究揭示了动静脉内皮分化过程中的转录组动态变化，揭示了MEF2C等基因在动静脉分化中的重要作用。通过体外和体内功能的深入表征，刻画了干细胞衍生的动静脉内皮细胞具有不同的骨架排列，细胞形态和生理功能。有意思的是，引入TIE2-L914F突变的iPSC衍生动脉内皮并不具有静脉内皮所呈现的“畸形”特征（过度增殖，细胞排列异常，凋亡减少等），提示我们内皮细胞的精确分型或者说器官特异的内皮细胞对于研究特定血管疾病乃至器官再生的重要性。总之，这一研究为静脉内皮相关疾病的模拟提供了更为精确的细胞模型，深化了我们对动静脉内皮发育分化调控机制的理解，是对于小鼠和斑马鱼等经典血管发育模型的一种补充。

专家点评

张健（上海交通大学）

本研究彰显了人工智能（AI）在药物开发领域引发的革命性进展。北京大学王凯研究员牵头的研究团队首先构建了带有TIE2突变的血管畸形（VMs）细胞模型，随后运用深度学习系统DLEPS，结合基因表达分析和DRUG-Seq技术，成功预测并筛选出Bosutinib作为有效干预手段在治疗VMs上的新突破；在系列生物学实验的机制研究中，进一步证实Bosutinib能显著抑制血管生成相关途径，展现出其治疗潜力。DLEPS技术由谢正伟团队基于AI和基因指纹开发，它突破了传统药物筛选的局限，无需预先了解药物靶标。与能够预测靶点蛋白三维结构的AlphaFold技术不同，DLEPS直接建立了小分子药物与基因表达调控之间的联系，从而能够更快速、高效地识别出候选药物。总体而言，这项研究为AI在药物发现中的应用，尤其是在血管畸形治疗领域，提供了有力的例证，并突显了AI在加速药物开发和深入探究疾病机制方面的重大潜力。

原文链接：

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1934590924003771

制版人：十一

参考文献

1. Behravesh, S., Yakes, W., Gupta, N., Naidu, S., Chong, B. W., Khademhosseini, A., & Oklu, R. (2016). Venous malformations: clinical diagnosis and treatment. Cardiovascular diagnosis and therapy, 6(6), 557–569. https://doi.org/10.21037/cdt.2016.11.10

2. Uebelhoer, M., Nätynki, M., Kangas, J., Mendola, A., Nguyen, H. L., Soblet, J., Godfraind, C., Boon, L. M., Eklund, L., Limaye, N., & Vikkula, M. (2013). Venous malformation-causative TIE2 mutations mediate an AKT-dependent decrease in PDGFB. Human molecular genetics, 22(17), 3438–3448. https://doi.org/10.1093/hmg/ddt198

3. Kangas, J., Nätynki, M., & Eklund, L. (2018). Development of Molecular Therapies for Venous Malformations. Basic & clinical pharmacology & toxicology, 123 Suppl 5, 6–19. https://doi.org/10.1111/bcpt.13027

4. Cooke-Barber, J., Kreimer, S., Patel, M., Dasgupta, R., & Jeng, M. (2020). Venous malformations. Seminars in pediatric surgery, 29(5), 150976. https://doi.org/10.1016/j.sempedsurg.2020.150976

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