闭环诊疗一体微凝胶调节免疫微环境、重塑肠道菌群并促进溃疡性结肠炎的治疗

示意图：装载有纳米凝胶的 治疗性“集束弹”微凝胶的制备及其治疗溃疡性结肠炎和体内ROS监测过程。

炎症性肠病（IBD）是一种常见的特发性炎症性疾病，主要包括溃疡性结肠炎和克罗恩病 。尽管IBD的病因和发病机制尚不完全清楚，但IBD的一个典型特征是活性氧（ROS）的爆发，这些ROS源自胃肠道粘膜和浸润的免疫细胞，并需要在适度范围内精确控制。过量的ROS在局部积聚会导致肠道上皮细胞凋亡，进而触发肠道屏障功能失调和肠道微生物群失调。口服药物作为主要的治疗手段，其在胃肠道的输送过程仍然存在很多未知问题。因此，监测病理生理信号对于探究IBD中复杂且不断变化的病理微环境、开发精准的治疗方案至关重要。

为开发一种结合实时监测和精确治疗的闭环策略，本文设计了一种具有“集束弹结构”的诊疗一体微凝胶。首先，响应ROS的超支化聚合物（HBPAK）与甲基丙烯酸透明 质酸（HA-MA）交联，制备载有尿石素A（UA）的纳米凝胶作为治疗剂。HBPAK作为一种响应ROS的超支化聚合物，起到ROS的清除功能。HA-MA是纳米凝胶的骨架，同时也是针对CD44的靶向成分。这些纳米凝胶与包含超氧阴离子特异性探针（TPC）的海藻酸溶液混合。通过电喷雾方法，在收集浴中通过钙离子交联形成诊疗一体微凝胶。所得的“集束弹结构”微凝胶内部均匀负载含有UA的纳米凝胶，外部是由钙离子交联而成的海藻酸基质。

图1. a) 集束弹微凝胶结构示意图。b) 微凝胶的代表性光学图像。c) 在明场（BF）和荧光模式下，微凝胶的代表性共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）图像。d ) HT-29和RAW264.7细胞与微凝胶提取物孵育后的存活率，n = 3。e) 显示微凝胶在模拟胃液（SGF）、模拟肠液（SIF）和模拟结肠液（SCF）中不同时间降解过程的代表性图像。f) 诊疗微凝胶在不同溶液以及模拟胃液（SGF）、模拟肠液（SIF）和模拟结肠液（SCF）条件下的药物释放曲线，n = 3。

在体内成像实验中，首先建立了溃疡性结肠炎（UC）的动物模型。通过灌胃递送含Cy-5.5标记的纳米凝胶的集束弹微凝胶，监测不同时间点材料在消化道的分布情况，确 定检测化学发光（CL）信号的时间点。然后，分别对健康组、疾病组和治疗组在不同治疗天数后活体成像，并量化组织原位的CL强度以及髓过氧化物酶（MPO）含量，评估疾病进程。

图 2. a) 实验设计示意图。小鼠被给予无菌水或含有3% DSS的水5天后，通过口服方式给予微凝胶，并在不同时间点处死以收获结肠进行分析。b)微凝胶在不同时间沿胃肠 道分布的结肠荧光图像。c) 微凝胶在24小时后保留情况的结肠荧光图像。d) 实验设计示意图，显示DSS和微凝胶给药的时间点。e) 在不同处理后，不同时间拍摄的小鼠的化学发光（CL）图像。f) 通过整合发光区域计算的小鼠体内诊疗微凝胶的CL强度。n = 5。

从治疗效果的角度来看，在结肠环境中微凝胶崩解，释放的纳米凝胶通过HBPAK组分清除ROS和UA调节肠道微生物群落的协同效应，有效地缓解了急性炎症并促进了组织修复。病变部位的治疗纳米凝胶能够下调ROS水平，从而减弱发光信号，表明炎症得到了缓解。此外，这种治疗策略在调控炎症因子的平衡、抑制M1型巨噬细胞的极化和上调结肠上皮 细胞紧密连接蛋白的表达方面作用显著，这有助于维持肠道屏障的完整性。结肠上皮组织和粘膜层的完整性将为肠道微生物群落提供更好的生态位，促进了益生菌的丰度和整体菌群多样性的提升，有利于维持结肠环境的稳态。因此，该体系因其简便的制备过程和多变的组成，有相当高的应用潜力。同时，也提供了一种实现闭环诊断和治疗策略的新方法，尤其适用于像IBD这样的难治性自身免疫疾病。

图 3. a) 结肠中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10和TGF-β1的mRNA水平。b) 血清中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10和TGF-β1的浓度。调控结肠组织中巨噬细胞极性。n = 5。c) F4/80+ CD86+巨噬细胞的流式细胞仪分析。d) F4/80+ CD206+巨噬细胞的流式细胞仪分析。结肠组织中e) F4/80+ CD86+和f) F4/80+ CD206+巨噬细胞的定量结果。n = 3。g) 小鼠结肠 组织中CD86和CD206水平的WB分析。通过ImageJ软件从g)定量相对h) CD86和i) CD206水平。j) 结肠组织中M1型巨噬细胞（CD86红色，F4/80绿色，DAPI蓝色）和M2型巨噬细胞（CD206紫色，F4/80绿色，DAPI蓝色）的免疫荧光分析。n = 5。

图 4. a) 结肠切片的代表性免疫荧光图像（ZO-1紫 色，Occludin绿色，DAPI蓝色）。b) 小鼠结肠组织中ZO-1、Occludin和Claudin 4水平的WB分析。通过ImageJ软件从b)定量c)相对ZO-1水平、d) 相对Occludin水平、e) 相对Claudin 4水平。n = 5。

图 5. a) 不同组别肠道微生物群落相对丰度的柱状图（门水平）。b) 微生物群落组成的热图分析（科水 平）。c) α-多样性指数的Simpson和d) Shannon。e) 病理条件下经诊疗微凝胶处理组的细菌多样性变化的LEfSe分析。f) 肠道微生物群落β-多样性的主坐标分析。每个点代表一只小鼠。g) 不同组别中显著丰度的属的LDA分析。显示LDA显著性阈值为2的分类群。h) 属和i) 物种水平上肠道微生物群落相对丰度的变化。n=5。

论文共同第一作者为浙江大学 博士生金泽原和张雅琪，浙江大学高分子系的高长有教授和刘文星副研究员与浙江大学医学院附属第一医院的李兰娟院士为该文章的共同通讯作者。

浙江大学高分子科学与工程学系高长有教授 ： 博导，国家杰青，国际生物材料学会、美国医学与生物工程院、英国皇家化学会、中国生物材料学会会士。主要从事组织修复与再生材料、自适应性生物材料、抗菌生物材料、生物材料表界面改性、纳米生物材料和医疗器械研发。作为负责人先后承担科技部、基金委等项目多项。在Angewandte Chemie、Advanced Materials、Biomaterials等本学科国内外核心期刊发表论文600余篇，被他人引用20000余次；个人H因子86。编著有《自适应性生物材料》《医用高分子材料》《Polymeric Biomaterials for Tissue Regeneration: From Surface/Interface Design to 3D Constructs》。授权国家发明专利近百项。获浙江省科技奖一等2项、二等1项。现任《Biomaterials Advances》《Progress in Materials Science》副主编。

课题组主页：

http://tac.polymer.zju.edu.cn/biomaterials/Chinese/ 。

浙江大学高分子科学与工程学系刘文星副研究员 ： 博导，主要研究兴趣为响应性高分子的设计合成及其在聚合物的降解、回收和生物医药等领域的应用。在J. Am. Chem. Soc.、Nat. Commun.、Small等期刊发表SCI收录文章20余篇。授权国家发明专利2项。

浙江大学医学院附属第一医院李兰娟院士 ： 中国工程院院士，浙江大学教授、主任医师、博士生导师，传染病重症诊治全国重点实验室主任，国家感染性疾病临床医学研究中心主任，国家内科学（传染病）重点学科学术带头人。长期从事传染病临床、科研和教学工作。主编出版了我国首部《人工肝脏》《感染微生态学》和教育部规划教材《传染病学》等专著，论文在Nature、Lancet、NEJM、CELL、Engineering 等国内外优秀期刊上发表。荣获国家科技进步奖特等奖，国家科技进步奖一等奖和二等奖，联合国教科文组织—赤道几内亚国际生命科学研究奖、浙江省科技大奖、光华工程科技奖、全国创新争先奖章、“全国优秀科技工作者”、“全国优秀党员”，“全国三八红旗手”和“全国抗击新冠肺炎疫情先进个人”等荣誉称号。