文献解读 | 代谢组学助力动物肉质品质研究

代谢组学和转录组学分析牛脂肪酸组成的调节特征

期刊： RNA Biology

时间： 2020.10

IF： 5.53

2020年10月，浙江大学动物科学学院在RNA Biology发表了名为“ Gene co-expression and alternative splicing analysis of key metabolic tissues to unravel the regulatory signatures of fatty acid composition in cattle ”的研究论文。 本研究是基于代谢组和转录组学技术，分析了牛的四个关键代谢组织(瘤胃、肝脏、肌肉和背脂) 转录组数据和脂肪酸组成，探讨了这些组织促进牛FAs形成的分子调节机制。

牛肉是人类饮食中重要的脂肪酸来源，在人类营养和健康中起着至关重要的作用。基于人类食用某些类型的脂肪酸所带来的健康风险，一些牛肉脂肪酸可以被定义为健康或不健康的脂肪酸。其中，t11-18:1、C18:3n-3、c9、t11-18:2的健康FAs，以及C14:0、C16:0、t10-18:1的不健康FAs研究最为广泛。然而，开发增加牛肉中健康脂肪酸的策略仍然具有挑战性，因为动物之间脂肪酸形成的差异很大，牛的脂肪酸合成和代谢非常复杂，涉及多个组织中的许多生物过程。先前研究缺乏对分子水平上调节脂肪酸合成的作用模式的全面理解。 本研究利用转录组和代谢组学方法，分析了高和低健康/不健康脂肪酸比例的动物的四个组织中的脂肪酸谱、差异表达基因、共表达基因和选择性拼接。确定了潜在的系统脂肪酸合成/沉积调节机制，包括关键基因、转录因子、腺苷酸基因和生物功能 。这对于未来的牛育种、肉类科学、人类营养和健康起到积极的作用。

背部脂肪组织中鉴定出9个分类中的49种脂肪酸。本研究中分析的健康FAs涉及t11-18:1、C18:3n-3和c9、t11-18:2，不健康FAs包括C14:0、C16:0和t10-18:1。脂肪酸的浓度分布在不同动物间呈现相似的模式，其中c9-18:1 (~38.0%)、C16:0 (~27.2%)、C18:0 (~11.6%)、c9-16:1 (~5.2%)和C14:0 (~3.8%)是最丰富的脂肪酸，占背脂组织中总脂肪酸的80%以上(图2A)。

顺-单不饱和脂肪酸和直链饱和脂肪酸是背部脂肪组织中含量最多的脂肪酸类型，其相对浓度分别为49.01±3.65%和44.47±3.36%(图2A)。健康和不健康的脂肪酸组成在不同的动物中有很大的差异。t11-18:1的比例为0.169-1.027%( CV= 42.04)，C18:3n-3的比例为0.059-0.197%( CV= 24.82)，c9，t11-18:2的比例为0.009-0.552%( CV= 61.20)，C14:0的比例为2.675-5.427%( CV= 16.83)，C16:0的比例为21.320-31.561%( CV = 9.19)，t10-18:1的比例为0.194-3.473%( CV = 51.60)(图2A)。这些导致健康/不健康的FA比率范围从0.0089到0.0557。

主成分分析显示，49种脂肪酸的分布没有按品种进行分离(图2B)。健康/不健康脂肪酸比例也不受品种影响(P = 0.11)。高比例组背部脂肪组织中t11-18:1、C18:3n-3、c9、t11-18:2的相对浓度均显著高于低比例组(FDR < 0.001，图2C)。对于不健康的FAs，高比率组中C16:0和t10-18:1的比例显著低于低比率组(FDR < 0.001)，而在低比率组和高比率组之间没有观察到C14:0比例的显著差异(FDR = 0.059，图2C)。

图2. 48只动物背部脂肪组织中49种脂肪酸的相对浓度及其在三个品种之间和不同脂肪酸比例组之间的差异。

主成分分析图显示，不同样品中剪接位点的表达谱按组织聚类，三个品种之间没有分离(图3A)。根据我们的结果，与其他三种组织相比，瘤胃组织具有最显著不同的剪接位点和内部变异的表达谱(图3A)。

在四种组织的成对比较中，使用FDR < 0.05和|dPSI| > 0.1的截止值，识别出669至1，531个显著不同的选择性拼接事件(图3B)。其中，当分别与肝脏、肌肉和背部脂肪组织比较时，瘤胃组织显示出669、1，358和1，531个显著不同的选择性拼接事件(图3B)。进一步的分析确定了两个瘤胃高度保守选择性拼接事件(与SLK和CD44基因相关)，在瘤胃组织中PSI > 0.85，在另外两个组织中PSI < 0.1(图3C)。在另外两个组织中检测到另外7个选择性拼接事件(与CLSTN1、EPB41、CD46和TPM4基因相关)，但在瘤胃中不存在，在瘤胃中PSI < 0.1，在另外两个组织中PSI > 0.85(图3D)。

图3. 瘤胃、肝脏、肌肉和背部脂肪组织的剪接位点表达谱和选择性剪接事件分析。

A.四种组织中剪接位点表达的主成分分析评分图。每个点代表一只动物的一个组织样本。瘤胃、肝脏、肌肉和背部脂肪组织分别用绿色、红色、蓝色和棕色表示。实心方形、圆形和三角形分别代表金塞拉、安格斯和夏洛莱品种。圆圈表示显著的集群。B.任何两个组织之间明显不同的选择性剪接事件的数量。C-D.瘤胃组织中高度保守和缺失的选择性剪接事件的韦恩图。PSI:拼接百分比。

黄色(R = -0.34， P = 0.03)和黑色(R = -0.31， P = 0.05)基因模块与瘤胃组织中的脂肪酸比例显著相关，瘤胃组织中分别含有915和308个共表达基因(图4A)。在肝脏中，三个基因模块与FA比率显著相关，包括浅绿色(R = -0.28， P = 0.05)、粉色(R = -0.31， P = 0.03)和鞍褐色(R = 0.32， P = 0.03)模块，它们有118、248和37个共表达基因(图4A)。在肌肉中，包括粉色(R = 0.48， P = 0.001)和青色(R = 0.5， P = 0.0005)两个基因模块共表达146和49个基因，与FA比值呈显著正相关。另外两个基因模块包括橙红色(R = -0.32， P = 0.03)和蓝绿色(R = -0.37， P = 0.01)模块与健康/不健康脂肪酸比例呈负相关(图4A)。分别含有240个和468个基因的背脂肪组织洋红色(R = 0.48， P = 0.0006)和红色(R = 0.32， P = 0.03)中的两个基因模块与健康/不健康脂肪酸比和c9、t11-18:2呈正相关(图4A)。火山图显示153(上调60，下调93)，120(上调56，下调64)，102(上调71，下调31下调)和138个(56个上调和82个下调)基因分别在瘤胃、肝脏、肌肉和背部脂肪组织中的高和低脂肪酸比例组之间显著差异表达(|log2FC| > 1 & P < 0.05，图4B)。在瘤胃、肝脏、肌肉和背脂肪组织中，总共有3个(1个互斥外显子(MXE)和2个跳过外显子(SE))、4个(1个替代5’剪接位点(A5SS)和3MXE)、5个(2个替代3’剪接位点(A3SS)、1个A5SS、1个SE和1个保留内含子(RI))和7个(1个A3SS、2个MXE、3个SE和1个内含子)预测的选择性剪接事件在高和低FA比率组之间分别有显著差异(FDR < 0.05)(图4C)。

图4. 瘤胃、肝脏、肌肉和背部脂肪组织中脂肪酸比例相关的共表达基因、差异表达基因和选择性剪接事件。

A:健康/不健康脂肪酸(FA)比例与四种组织中的共表达基因模块显著相关。还指出了每个模块中的基因数量。B .四种组织中高、低FA比值组差异表达基因的火山图。C .四种组织中高和低FA比率组中不同类型的预测选择性剪接事件的数量。

我们从去重复后的DEGs(n = 153)、module基因(n = 1，223)和AS基因(n = 3)的总和中发现瘤胃中有1，341个FA比值相关基因。同样，在肝脏、肌肉和背脂肪组织中分别发现了498、4，450、792个FA比值相关基因，其中包括120、102、138个DEGs、403、4，643、708个模块基因，以及分别在三种组织中发现的4、5、7个选择性剪接基因。瘤胃、肝脏、肌肉和背部脂肪组织中的健康/不健康脂肪酸比例相关基因涉及942、231、1，424、387个GO条目，其中330、19、511、57个GO条目显著富集(FDR < 0.01)。

在至少3个不同组织中鉴定了66个健康/不健康脂肪酸比例相关基因(图5A)。其中，8个基因在所有四种组织中都有共同的特征(图5A)。这8个共有的关键基因包括CDK5 regulatory subunit associated protein 1 like 1 ( CDKAL1 )、heparan sulfate proteoglycan 2  ( HSPG2 )、replication timing regulatory factor 1 ( RIF1 )、protoporphyrinogen oxidase ( PPOX )、dishevelled associated activator of morphogenesis 1 ( DAAM1 )、ubiquitin specific peptidase 33 ( USP33 )、zinc finger protein 782 ( ZNF782 )、centrosomal protein 290 ( CEP290 )。

我们基于8个关键基因进一步鉴定了9个转录因子，包括NKX2-1 (NES = 6.14)、PRRX2 (NES = 6.04)、FOXO1 (NES = 5.94)、RBPJ (NES = 5.56)、ZNF143 (NES = 5.46)、TBX21 (NES = 5.33)、HBP1 (NES = 5.31)、GATA1 (NES = 5.10)、FOXO4 (NES = 5.07)(图5B)。构建了转录因子和关键基因相互作用以及关键基因-关键基因关系的网络(图5B)。NKX2-1显示出最大的调节功能，并调节5个关键基因 (HSPG2、USP33、CDKAL1、ZNF782 和 DAAM1 )(图5B)。 DAAM1 是所有9个转录因子调节的唯一基因(图5B)。 CEP20 与 CDKAL1 (R = 0.70)、 RIF1 (R = 0.89)、 DAAM1 (R = 0.80)、 USP33 (R = 0.61)和 ZNF782 (R = 0.83)高度相关。

图5. 与瘤胃、肝脏、肌肉和背部脂肪组织中健康/不健康脂肪酸比例相关的关键基因。

A从四种组织中脂肪酸比例相关的差异表达基因、共表达基因和选择性剪接基因中鉴定的基因的韦恩图。 B 8个关键基因和预测转录因子(TFs)的网络图。NES:标准化浓缩分数。

非靶向液相色谱-HRMS数据的综合代谢组学分析为兽药残留的来源提供了有价值的见解

期刊： J Agric Food Chem

时间： 2020.11

IF： 4.192

2020年11月，德国 Justus Liebig University 食品化学和食品生物技术研究所在J Agric Food Chem发表了名为 “Comprehensive Metabolomics Analysis of Nontargeted LC-HRMS Data Provides Valuable Insights Regarding the Origin of Veterinary Drug Residues ”的研究论文。 本研究是基于非靶向代谢组学方法，分析了感染动物和健康动物的猪肌肉组织中代谢物变化，探讨了这些代谢变化是区分感染动物和健康动物的生物标记物 。

代谢组学通常是获取被调查样本的深入信息的重要工具。代谢组学方法广泛用于临床或药物应用、癌症研究或药物发现中的生物标志物发现，同时也已成功应用于食品安全、食品质量和可追溯性。代谢组学方法有两种策略，即代谢指纹和代谢概况。代谢组学用于兽药残留监测是一个新兴的研究领域。到目前为止，关于这一主题的研究还很少发表。两个例子包括对以前分别用阿莫西林或恩诺沙星处理过的鸡的组织样本进行分析。另一项研究调查了类固醇治疗后牛尿的代谢变化。 本研究利用非靶向代谢组学方法，分析了药物治疗的受感染动物代谢变化的潜在生物标记物，并用于常规兽药监测 。

如图1所示，两种五氯苯甲醚模型都揭示了未经处理的健康动物样本(对照)和经药物处理的受感染动物样本(阳性样本)之间的差异。由于所有质控样本在图中一致，样本制备和数据处理工作流程被认为是稳健的。基于主成分分析和随后的QDA的错误*/+分类数分别为19.8%(Q-Orbitrap)和26.7%(Q-TOF) (见图1)。模型的特异性分别达到0.976和0.923。0.826 (Q-Orbitrap)和0.810 (Q-TOF)的灵敏度也令人满意。因此，两种HRMS系统显示了相似的结果，虽然假阳性率(错误地分类为感染)的Q-TOF方法略高。有趣的是，在两个模型中，质控样本与对照样本位于同一聚类中，加标有70种兽药。这些结果表明，阳性和对照猪肌肉样品之间的主要差异源于代谢组的变化，而不是由于兽药的存在。

图1. HRMS数据的主成分分析是通过用Q-Orbitrap质谱仪(A)和Q-TOF质谱仪(B)检查猪肌肉样品获得的。

在研究设计过程中，我们还研究了样品储存时间和动物性别的影响，但是这些因素并没有影响。通常猪在育肥后6个月左右屠宰。因此，所有对照样品由来自育肥猪的样品组成。阳性样本也包括来自大约3个月大的小猪的样本。

作者用单变量统计检验的方法筛选生物标志物。通过LC-MS的方法获得产物离子扫描显示特征片段和保留时间，并与参考标准进行比对从而对物质进行定性。结果显示，三肽脯氨酰苯丙氨酸甘氨酸(PFG)、lyso-PC 17:0、lyso-PC (C18:1) (图2)，另外还有一些前列腺素类物质和不饱和脂肪酸的氧化产物。

进一步的，作者还在代谢分析4.0中进行了“质谱峰到途径”的映射，以补充手动生物标志物识别。通过利用代谢途径的集体见解，将质谱特征映射到功能活动。1523个重要的质谱特征(p < 1.0×10 ^-5 )用于途径分析，105种经验化合物用“质谱峰到途径”进行注释。手动检查每条路径的显著点击的合理性(色谱保留时间和质谱鉴定)。途径富集因子计算为有效途径命中数与随机匹配化合物命中预期数之比。途径富集的显著性由费希尔精确试验的p值决定。花生四烯酸形成前列腺素 (FET p值:0.01，富集因子:1.76)和花生四烯酸代谢(FET p值:0.04，富集因子:1.95)形成前列腺素，然后是亚油酸代谢(FET p值:0.10，富集因子:1.50)的显著性为这些结果与我们手动进行的生物标记注释是匹配的（图3）。

图2. 代表性物质离子光谱。

上图：三肽PFG(M/z 320.1599[M+H]+2.09 min)。通过参考标准确认特征片段。下图：lyso-PC衍生物570(M/z 570.3394[M+H]+6.75 min)。m/z 86、184、125和104是溶血磷脂酰胆碱(lyso-PC)的特征片段，并通过参考标准进行了确认。

图3. 路径映射摘要:所有匹配的路径都显示为圆圈

研究表明，三肽基序和溶血卵磷脂在抗炎药物开发的过程中得到广泛研究。因此，作者将三肽PFG和lyso-PC衍生物570作为研究中的特异性标记物。基本原理是：两种分析物都是前五种最重要的分析物，并且实现了色谱基线分离。此外，两种分析物的身份至少在物质类别水平上得到验证。两种候选生物标志物的峰面积除以内部标准氧代吡啶酸的峰面积。这一参考程序产生了独立于运行的值，这些值可以与其他测量值进行比较。50个阳性和50个对照猪肌肉样品在一年的时间里进行了多次分析，对这两个候选生物标志物进行了回顾性评估。比率通过取其自然对数进行转换，然后在散点图中可视化。如图4所示，对照样本的对数转换值似乎遵循二元正态分布。

图4. 两种候选生物标志物三肽PFG和lyso-PC衍生物570 (内标:氧喹酸-d5)的对数转换响应比的双变量数据分析。

总之，目前的研究清楚地表明，采用代谢指纹法适用于区分来自健康对照动物的猪肌肉样品和来自药物处理的感染动物的样品。这种方法的高重现性是通过两种不同的全球可用的液相色谱-HRMS系统(Q-Orbitrap和Q-TOF)来证明的。此外，还应用了非靶向方法来识别候选生物标志物，以区分来自健康猪的污染样品和来自药物治疗的感染样品。人工生物标记注释和路径图揭示了前列腺素形成和不饱和脂肪酸代谢的变化，作为感染和炎症的既定标志。对于日常常规，使用两种生物标记物(三肽PFG和lyso-PC衍生物570)开发了统计分析程序。在实际样品上应用这种可靠的方法，可以明确地识别被感染的样品。