自动化生产高效靶向CD20的CAR-T细胞的临床应用

目前修饰的T细胞是治疗晚期造血系统恶性肿瘤、实体瘤和感染性疾病的最有希望的治疗方法之一，因此对过继性细胞治疗（ACT）的重要性和潜力予以支持。表达抗CD19嵌合抗原受体（CAR）的工程化T细胞已经在针对白血病和淋巴瘤的若干临床试验中显示出显着和持久的反应。然而，尽管抗CD19 CAR T细胞在科学和医学方面取得了成功，但由于T细胞持续性差，功能不足或损失CD19，仍然有相当数量的患者对这种基于细胞疗法无效。在接受CD19定向治疗的复发/难治性B细胞急性淋巴细胞白血病（ALL）患者中约30%可观察到这种复发，并且总是有非常不良的预后。

超过90% B细胞淋巴瘤患者以及一小部分维持黑素瘤细胞的CD20稳定表达高水平。 根据这一观察结果，利妥昔单抗，一个抗CD20特异性单克隆抗体对包括弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL），滤泡淋巴瘤和慢性淋巴细胞性白血病（CLL）在内的淋巴瘤具有主要临床影响。有趣的是，在案例研究中，利妥昔单抗还诱导临床II期临床试验（临床试验政府识别号NCT01376713）患者的转移性黑素瘤退化。由于工程化T细胞的突出效力，使用抗CD20 CAR表达T细胞代替利妥昔单抗，可能进一步改善对治疗转移性黑素瘤和B细胞恶性肿瘤的临床影响。

因此，我们着手开发针对这种适应症的抗CD20 CAR T细胞，并产生包含针对CD20并连接到细胞内信号传导结构域（4-1BB_CD3ζ）的细胞外单链可变片段（scFv）的第二代CAR构建体。

制造CAR T细胞是复杂的。它需要熟练的操作员以及专用的基础设施。当前进程面临很大的挑战为满足于不断地成功。在这项研究中，我们试图开发，优化和验证在CliniMACS Prodigy平台上的全封闭，自动化T细胞转导（TCT）过程，以在不到两周的时间内在封闭条件下从白细胞分离术（LP），血沉棕黄层（BC）或全血（WB）开始制备基因工程T细胞。该系统已经被证实用于从健康捐献者（HD）的LP开始，依照现行药品生产管理规范按临床规模生成工程化T细胞。 然而，我们证明了TCT方法用于制备抗CD20 CAR T细胞的合格性，其中起始材料也是从很大程度预处理的患者供体材料（PM）获得的。此外，我们通过不同操作人员在不同日期使用不同设备来评估稳健性和可重复性。在这里我们报告了由健康捐献者（HD）和很大程度预处理的患者供体材料（PM）所产生CAR T细胞的细胞组成、表型和功能，并表明发展过程的充分性。

从健康供体HD获得新鲜血沉棕黄层（DRK Dortmund）或非动员白血球分离（UniversitätsklinikumKöln或DRK Ulm），通常在献血后24-48小时后使用。 运输在室温（RT）下进行。对于来自弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）患者的非动员白细胞去分离产品或来自黑素瘤患者的全血样品的T细胞制备，由UniversitätsklinikumKöln提供。弥漫性大B细胞淋巴瘤DLBCL患者进行了大量的预处理，并且经历了收获的复发时间。 在外周血中没有对白细胞分离术或前处理的全血样本（如淋巴细胞缺失，化疗或治疗性抗体）或存在或白血病的数量设定排除标准。

JeKo-1细胞系获自莱布尼茨研究所DSMZ（DSMZ编号：ACC 553）并在补充有10%FBS（Biochrome）的RPMI 1640中培养。

自动T细胞转导（TCT）整个过程中使用了Clini MACS Prodigy与TS520结合。选择TCT应用程序后，当前研究中所有刺激，洗涤，培养的参数可以给用户作为预加载的条件。单独使用的一次性管道TS520包括一个泵管，一个用于免疫磁珠法分离的分离柱，一个用于细胞处理和培养的腔室，几个用于缓冲液，培养基，试剂，产品袋和废物的输入和输出管线。Apel等人先前已经详细描述了技术特征。

处理之前在CliniMACS Prodigy上分析血液产品的总WBC浓度和靶细胞频率（CD45+中的CD4+和CD8+），并最多处理3x10 ⁹ 个靶细胞。在开始自动化过程之前制备补有0.5% BSA（Miltenyi Biotec）或0.5% HSA（Grifols）的缓冲液CliniMACS PBS/EDTA和补充有3% 热灭活的人AB血清（Gemini Bio-生物素，最多25个供体汇集）、12.5ng/mL重组人IL-7和12.5ng/mL重组人IL-15（全部Miltenyi Biotec）的TexMACS GMP培养基（Miltenyi Biotec）。将过程参数输入到“活动矩阵”中，以便定义自动运行的条件。仪器在4-8℃下进行初始引发，样品制备和细胞标记。使用CliniMACS CD4试剂和CliniMACS CD8试剂（均为Miltenyi Biotec）在4-8℃下进行用磁珠标记细胞30分钟。磁分离后，靶细胞在TexMACS GMP培养基中洗脱，操作人员确定富集部分的细胞浓度并输入应用程序。对于自动化培养，根据制造商的说明从含有富集的T细胞的袋中自动将2×10 ⁷ 个至最多1×10 ⁸ 个细胞转移到CliniMACS Prodigy的室中，洗涤，然后用1个小瓶（4ml） MACS GMP T细胞TransAct（Miltenyi Biotec）活化至终体积70ml含有细胞的培养基（相应于试剂稀释度的17.5倍）。使用慢病毒载体在T细胞激活后24小时转导T细胞。为了除去过量的刺激试剂和慢病毒载体，在刺激三天后自动进行培养洗涤，并将培养从静态培养切换到搅动培养。培养体积增加，随后通过自动添加至250mL。每天通过离心最多更换180mL培养基，来进行自动化培养基交换。培养6天后，更换培养袋（TexMACS GMP补充12.5ng/mL重组人IL-7和12.5ng/mL重组人IL-15（全部Miltenyi Biotec），第二个介质袋不使用热失活的人AB血清）。使用补充有2.84%HSA（Grifols）的TexMACS培养基或Composol（Fresenius）进行细胞培养液配制和收获。培养时经常取样。

通过血细胞计数器和赤藓红B染色分析细胞计数以及存活力。使用pH测试条（MColorpHast，pH6.5-10，Merck）测量培养样品的PH值。使用手持式血糖计（ACCU-CHECK Aviva）测量葡萄糖浓度。对于浓缩部分（第0天），进行对照（第5天/ 6天）和最终细胞产物（第12天）样品进行流式细胞术分析以确定细胞组成，T细胞表型和转导效率。

T细胞自动转导（对于每次运行，将200×10 ⁶ 个转导单位配制在10mL培养基中，转移至150mL转移袋（Miltenyi Biotec）并无菌连接至Tubing套装）以表达PGK启动子驱动的CAR靶向CD20+细胞。通过在SupT1细胞上滴定浓缩的LV制剂来定义转导单位。因此，构建慢病毒抗CD20 CAR编码包括leu-16派生scFv单链抗体与CD8隔离域、一个CD8跨膜区与4-1BB和CD3ζ信号分子，这些都是基于由H提供的逆转录病毒抗CD20 CAR载体而设计的。最初由Schmidt等人描述 ¹⁵ 。使用HEK293T细胞产生VSV-G假型化的慢病毒载体，将上清液浓缩并储存在-70℃直到转导。在CFX96 Touch TM实时PCR检测系统（Biorad）上进行Tagman双重实时定量PCR以确定载体拷贝数。为了定量整合的原病毒，设计引物和探针，特异性扩增5'LTR和内部启动子之间的89bp片段。如Maetzig等人所述类似地定量细胞参考基因 ²⁵ 。构建含有病毒和细胞靶序列的质粒并作为标准。计算病毒与细胞拷贝的比例，并考虑转导效率来确定仅转导细胞的VCN。

为了评估工程改造的T细胞的细胞溶解活性，用1μMCellTraceTM紫罗兰（Life technologies）标记1×10 ⁴ 个CD20+ JeKo-1细胞，并在96孔板底部与指定的效应物处的抗CD20CAR T细胞一起共培养24小时以达到目标细胞比率。通过流式细胞术定量存活的紫罗兰标记的靶细胞检测特异性裂解。使用模拟转导的T细胞作为对照，以相同的效应物达到目标比率。

将1×10 ⁵ 个JeKo-1细胞和1×10 ⁵ 个抗CD20 CAR-T细胞在96孔圆底培养板中共培养24小时。按说明书使用MACSPlex细胞因子12试剂盒，在上清液中测定抗CD20 CAR-T细胞的细胞因子分泌。

在动物中进行的所有实验都遵循制度指导和规定。

为了分析所制造的T细胞的5x10 ⁵ 个Raji ^ffLuc 细胞的体内功能性，在小鼠中通过尾随注射NODscidγ（NSG）（NOD.Cg-Prkdc ^scid ll2rg ^tm1Wjl /SzJ）。7天后，静脉注射1×10 ⁶ 抗CD20 CAR T细胞或模拟Mock T细胞。在注射100μL（30mg/mL）XenoLight D-Luciferin-K ⁺ 盐生物发光底物后，使用体内成像系统（PerkinElmer）经常测量抗肿瘤响应（珀金埃尔默）。从两腿的股骨和胫骨收集骨髓样品。脾脏手动分离。 将红血细胞裂解并在流式细胞术分析之前使用CD45，CD3，CD4，CD8和CD19（全部Miltenyi Biotec）将样品染色。

科隆大学的机构审查委员会和伦理委员会批准本研究的样本采集。根据赫尔辛基宣言，每位患者在收集样本前都提供了书面知情同意书。

利用来自HD或PM的白细胞分离术（LP），全血（WB）和血沉棕黄层（BC）作为起始材料以评估全自动TCT应用在CliniMACS Prodigy（图.1）。在第0天，将冷冻保存的或新鲜的材料无菌焊接到闭合的管组（TS520）上以磁性分离CD4+和CD8+ T细胞，随后使用MACS GMP T细胞TransAct进行活化（基于纳米基质的多克隆T细胞刺激试剂，通过诱导CD3-CD28介导的细胞活化来改善转导过程）。对于病毒转导，在T细胞刺激后24小时，将VSV-G假型化的抗CD20 CAR慢病毒颗粒无菌地连接到管组。在随后的扩增阶段中从第6天至第11天每天都补充有重组人类细胞因子IL-7和IL-15 26的T细胞培养基TexMACS（并且直到第6天添加人类3%（v/v）AB血清的）。在第12天，将最终的细胞产物洗涤，在Composol（Fresenius）中配制并收获。在TCT过程的整个过程中，QC袋能够对细胞计数，活力，pH值和葡萄糖消耗进行在线评估。

CliniMACS Prodigy能够从不同的细胞样品和条件开始，实现基因工程化T细胞可再生的符合cGMP的生产 TCT 工艺评估15次，使用来自健康供体（HD）的4个白细胞分离术（LP）和1个血沉棕黄层（BC），2个来自弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）患者的LP和一个黑素瘤患者衍生的WB样品（表1），在起始材料方面存在很大的差异时测试过程的再现性，不仅它们的状态（新鲜或冷冻）不同，它们的异常细胞表型而且在开始该过程所用的有限量材料方面，或可能妨碍TCT过程的不同细胞组成。传入产品的流式细胞分析揭示了细胞组成的强烈差异。开始可行的CD3+细胞频率从4%（PM; WB-3）到83%（HD; LP-11＆LP-12）（表1）变化。当富集CD4和CD8结合时，获得大部分T细胞，然而因为CD8低表达，自然杀伤（NK）细胞和天然杀伤T（NKT）细胞共富集。即使它们是CD4dim，单核细胞也大大减少。粒细胞和B细胞普遍显着减少（图S1）。

在富集CD4+和CD8+ T细胞之后，典型地，将1×10 ⁸ 个细胞重新定向至腔室中，除非减少量的细胞可用（表1），而保留在靶细胞组分袋中其余的富集细胞冷冻保存以便以后使用。T细胞活化状态用集成显微镜相机观察活化T细胞的典型聚集检测来评估（图2A）。在早期静态培养阶段的这种定性测量使得能够在不扰动初始T细胞活化阶段也不需要采样（避免早期细胞丢失）的情况下进行第一过程中的控制。在动态扩张阶段（过去的第三天）细胞数量的测量显示了从第四天到第五天开始的指数增长的稳健的细胞扩增（图2B）。 所有的健康供体HD和弥漫性大B细胞淋巴瘤DLBCL运行产生可比较的扩展曲线。只有患有黑素瘤患者的血液显示出比起始细胞计数（2×10 ⁷ 个细胞）低5倍的相关的延迟。12天后的最终T细胞数量从黑素瘤患者的2.4×10 ⁹ 到DLBCL患者的3.2×10 ⁹ -4.9×10 ⁹ 和HD的2.9×10 ⁹ -6.3×10 ⁹ （图2C）。对运行的LP-9和LP-10没有观察到扩增，其中使用来自DLBCL患者的仅具有6x10 ⁷ 个冻存LP细胞作为起始数而不是通常的1x10 ⁸ 个细胞。 另外，来自PM的14.0×10 ⁶ ±3.7×10 ⁶ 个/mL细胞与来自HD的17.2×10 ⁶ ±5.5×10 ⁶ 个/mL细胞，对于最终的细胞密度没有显着差异（图2D）。存活率仍然很高（图2E），最终产物中存活的白细胞在统计学上没有显着差异，HD为90.4±4.3%，PM为88.4±7.4%（图2F）。然而，冷冻保存的产品显示以84.2%活细胞频率开始，在第六天达到最高的93.1±4.2%，然后在第十二天连续降低至80.7±2.4%（LP-9和LP-10数据）。来自DLBCL患者的新鲜细胞以相反的方式表现，开始时高达97.8%，同时下降到81.3±2.5%，回到91.8±0.7%（LP-4和LP-5数据）。总的来说，PM（65±36倍）和HD（43±14倍）达到可比较扩增率（图2G）。

如HD衍生的LP（图S2）所示，通过流式细胞术分析富含CD4/CD8的细胞的细胞组成。来自HD的富集的CD4/CD8组分主要由CD3+ T细胞组成（83.4±9.6%），而PM中只能检测到54.8±11.5%的T细胞（图3A），这直接反映了存在于患者起始材料中NK和NKT频率的增加（两个群体都是CD8dim和部分合并的）。此外，PM起始材料中CD3+ T细胞的频率为23.0±21.3%，HD为72.2±10.7%。 此外，与HD相比，PM测量出更多的B细胞（CD19+），单核细胞（CD14+），NK细胞（CD56+），NKT细胞（CD3+/CD56+）和粒细胞（CD16+/CD56+/SSC _hi ）。富集细胞的差异在自动扩张的十二天期间被废除，有利于T细胞生长（图3B）。因此，在最终产物中检测到相当的T细胞纯度，HD为91.3±5.0%，PM为88.3±7.1%。如在富集部分中已经检测到的，NKT细胞仍然是主要的污染细胞，HD频率为5.1±2.2%，PM为8.0±4.3%。使用流式细胞术，基于活CD3+细胞中表达分析T细胞的表型CD62L，CD45RO和CD95，如运行WB-3（图S3）所示。尽管初始T细胞（T _N ：CD45RO-CD62L+CD95-;26.1±16.5%），中心记忆T细胞（T _CM ：CD45RO+CD62L+CD95+; 22.0±13.0%）和效应记忆T细胞（T _EM ：CD45RO+CD62L-CD95+; 28.5 ± 10.6%)以相当水平表示HD富含部分，但PM富含细胞的分析揭示了向分化更高的效应T细胞（T _EFF ：CD45RO-CD62L-CD95+; 24.7±11.3%）的表型转变，而TN（7.3±0.5%）显着不足（图3C）。有趣的是，尽管在富集细胞中存在这些表型差异，HD的干细胞记忆T细胞（T _SCM ：CD45RO-CD62L+CD95+;45.0±11.2%）和T _CM （33.99±15.31%）和PM的T _CM （64.7±5.8%）的主要外观在最终产品中检测到（图3D）。 尽管如此，HD的记忆T细胞合并频率为79.0±13.5%，PM为87.1±7.7%。 分析CD4+和CD8+ T细胞的频率（图3E）以及CD4/CD8比率（图3F）揭示了富集级分中HD和PM之间的显着差异。然而，在最终产品中，比值从富集成分中的3.8±0.8（HD）和2.3±0.8（PM）变为HD中的2.0±1.6和PM中的1.9±0.9，其中差异消失（图3G＆3H）。