预计到 2025 年，胰腺癌将超过结直肠癌，成为仅次于肺癌的癌症相关死亡第二大原因。胰腺导管腺癌 （PDAC）的特征是明显的肿瘤间和肿瘤内异质性。虽然许多研究已经在转录水平上确定了不同的PDAC 亚型，但这些子类型的区分并不是绝对的。在多数患者的肿瘤中常客观察到多亚型并存的生态，这也与治疗反应和患者结局息息相关。现有研究已经证明，在许多癌症类型中，肿瘤内异质性
（ITH） 是通过现有或新出现的亚克隆驱动突变实现的。然而，
PDAC 在其进化根源上显示为多个克隆驱动突变，并且参与 PDAC 进展和治疗耐药性的 ITH 优先受非突变表观遗传重编程的调节，特别是表型可塑性。
事实上，癌细胞克服生理限制的表型可塑性的能力是偏离终末分化状态的关键特征，这种表型可塑性的“解锁”成为癌症的新兴标志。因此开发 PDAC 中 ITH 功能化相关生物标志物，对于构建通过状态门控和状态靶向策略来抑制癌症可塑性的新型治疗策略至关重要。
近日，
德国慕尼黑工业大学胰腺癌转化研究中心的Maximilian Reichert教授
率领团队开发了一种
分支类器官模型系统，它概括了 PDAC 的管状形态。
与目前的其他类器官模型系统相比，
分支类器官模型可以显示不同 PDAC 亚型以及单个肿瘤内的表型多样性，因此可以捕获瘤内和瘤间异质性。
作者团队生成了源自定义的转录PDAC亚型和患者衍生类器官的分支类器官的肿瘤异质性的形态学和转录表型景观。形态学上不同的类器官家族显示出与 PDAC 的关键生物学特征相关的独特功能特性，包括肿瘤细胞状态、上皮-间充质转化
（EMT） 可塑性、转移能力以及对细胞毒性和靶向治疗的反应。最后，通过类器官模型系统，并结合基于图像的全面表型分析和药物分型，确定了状态门控和状态靶向的单一疗法和组合治疗。
PDAC
分子亚型产生形态学上不同的类器官：
来自不同转录簇的 PDAC 细胞以克隆密度包埋在 3D 漂浮的 I 型胶原基质内，并生长 13 天以产生复杂的多细胞分支器官型结构。
在 13 天的发育过程中，上皮肿瘤类器官形成了多个主要分支和子分支，类似于一个复杂的导管网络。
第 10 天，上皮类器官达到最大大小，此时它们停止扩增，相当完全成熟，形成了末端芽和连接整个类器官体的无缝管腔。
相比之下，间充质肿瘤类器官看起来要紧凑得多，主要的类器官体密集地充满了细胞。
在第 7 天，间充质类器官达到临界质量并开始通过突起侵入胶原蛋白基质。最终，间充质类器官以侵袭方式生长，具有主要细胞核心和长分支，不断侵入基质并遵循线性生长方式。
接下来对分支类器官进行了转录组学分析，以测试这些类器官是否保留了其亲本 PDAC 细胞系的转录亚型。识别出两个独立的簇：上皮亚簇中富含脂肪酸代谢、OXPHOS、P53 信号传导和糖酵解等特征；而间充质亚簇中典型的基底样特征，如 EMT、E2F 靶点、Myc 靶点、Kras 信号传导和缺氧。在形态学水平上，当将原发性肿瘤（腺体与非腺体）与类器官结构进行比较时，分支类器官在很大程度上概括了体内肿瘤结构。此外，
这些单细胞衍生的分支类器官在一系列传代中保留了它们的分支能力和亲本类器官系的形态特征。
鉴于3D中分支类器官的复杂表型，接下来将上皮和间充质类器官的基因表达谱与相应的亲本2D
PDAC细胞进行了比较。在2D单培养中，发现了丰富的增殖特征，如E2F靶点和G2M检查点。相比之下，3D间充质类器官富含Hedgehog和Notch信号。有趣的是，在两种PDAC亚型中，
3D与2D富集基因特征的最显著差异之一是TGFβ信号通路。
总的来说，数据显示，
分支的PDAC类器官保留了它们的EMT特性，并根据亲本PDAC亚型建立了不同的形态。
此外，
分支的PDAC类器官激活了涉及基本发育和形态发生信号通路的不同转录程序。
图：PDAC 亚型产生形态不同的分支类器官。
PDAC
类器官中分支形成需要经典的 TGFβ 信号转导：
针对基因表达分析和鉴定 3D 或 2D 培养的 PDAC 细胞之间的差异调控通路，试图从功能上研究指导 PDAC 类器官分支形态发生的途径。
重点关注类器官培养物富集的关键发育途径（如 EGFR、Wnt/β-catenin、Hedgehog、Notch 和 TGFβ），并检查了它们对类器官形态的影响。
虽然 EGFR 和 Wnt/β-catenin 的操作并没有显着改变类器官的分支能力，但在靶向 Hedgehog 和 Notch 通路时观察到了细微的变化。GLI1/2 拮抗剂 GANT61 的给药导致细胞毒作用，尤其是在间充质亚型中，而进一步上游作用的 Smoothened 抑制剂 SANT-1 不会影响任一亚型的分支能力。使用 γ 分泌酶抑制剂 DAPT 抑制Notch 可减小两种类器官亚型的大小，并影响上皮亚型的亚分支数量。
通过操纵 TGFβ 信号传导观察到最明显的效果。TGFβ 是胰腺胚胎发育和致癌作用中的关键形态发生，特别是作为 EMT 的主调节分子。
基于匹配的 2D 单层和相应的 3D 分支类器官的转录谱，确定了 TGFβ 信号转导以及其他 EMT 介质（如 Ski 和 Junb）在源自上皮和间充质簇的 3D 类器官中显着上调。
用 TGFβ-1（EMT 诱导剂混合物STEMX）处理类器官，或与 TGFβ-RI 抑制剂A83-01 一起使用。与对照类器官相比，从培养第 0 天开始暴露于 TGFβ-1 或 STEMX 的类器官表现出生长停滞和上皮类器官的分散表型，细胞间接触减少。当在第 7 天施用 TGFβ-1 时，类器官表现出收缩和侵袭性表型，导致胶原凝胶极度收缩，使得通过明场显微镜进行类器官评估不可行。相反，A83-01 阻断了上皮和间充质肿瘤类器官中类器官分支的形成。总之，
TGFβ 信号转导对 PDAC 分支类器官形态发生至关重要，因为 TGFβ 抑制完全消除了分支。
同时，
在类器官发育的不同时间的 TGFβ 信号呈现程序化激活，因为类器官形成开始时的刺激会减少分支数量和厚度，而发育后期的刺激会导致类器官收缩。
图：TGFβ 信号转导对于上皮和间充质亚型分支类器官的形成至关重要
PDAC
类器官表型的构建：
对亲本的原代上皮和间充质 PDAC 细胞系进行了单细胞 RNA 测序 （scRNA-seq）。上皮和间充质 PDAC 亚型都确定了 5 个主要簇 ，
同时可以观察到不同簇的上皮间充质可塑性（EMP）/EMT评分存在异质性。接
下来确定来自相同转录亚型的类器官是否表现出固有的表型异质性。首先，可以直观地观察到几个不同形态亚群的形成。作为代表性的分析了三个上皮PDAC系（ID:8442、9591和53631）和三个间充质PDAC系的类器官形态（ID:8028、9091和16992）。在这两种PDAC亚型中观察到保守的类器官表型家族。
对于上皮亚型，定义了4个主要的形态类别/家族，即末端芽分支类器官（TEBBO）、囊性分支、厚分支和树状家族。
一般来说，分支上皮类器官由一个主分支和多个子分支组成。为了确定每种上皮类别的独特结构特征，将类器官大小量化为长轴长度、核心分支的厚度和主要分支的数量、节点（分支点）的总数、是否存在侵入性突起（尖峰分支）、末端管状结构、管腔形成和粒度。事实上，不同类器官之间存在关键特征。例如，
TEBBO家族的末端芽最多，囊性分支家族的微腔最多且管腔面积最大，厚分支家族显示最高的粒度水平，树状家族显示最多的节点和最具侵入性的分支。
源自 C1 簇的间充质类器官表现出表型多样性降低，有 3 个主要形态类别：
支链间充质、烟花和星状表型。
支链间充质类别中存在一个厚的核心分支，烟花类器官具有最多的分支，星状类器官形成一个圆形核心。
作者团队进一步开发了一种无偏倚的机器学习方法来捕获和量化单细胞衍生的 PDAC 类器官的表型异质性，称之为形态类器官表型异质性映射 （MOrPHeMap）。MOrPHeMap 是使用固定的（基于神经网络的）特征提取器生成的，该提取器最初使用4,113 个单独的类器官图像进行训练，以将类器官图像分类到各自的细胞系中。然后使用该网络从一组未知的1,579 张类器官图像中提取相关特征，然后使用 t-SNE 对其进行可视化。MOrPHeMap 得到的8个主要簇与专家人工分析非常匹配。当将细胞系分类叠加到MOrPHeMap上时，来自单个肿瘤的类器官的表型多样性变得明显。
总之，使用分支类器官分析，能够捕获与EMT过渡状态相关的预先存在的肿瘤细胞异质性。
同时该技术囊括了PDAC的表型异质性，从具有粗枝和末端芽（TEBBO）的分化良好的结构，让人联想到胰腺导管树，到具有数百个侵入性分支的高度侵入性类器官（星状与烟花）。
以克隆密度培养分支类器官可产生具有独特结构特征的可重复表型，强调了不同PDAC亚型之间以及内部的功能异质性。
图：细胞内异质性驱动类器官表型多样性
PDAC
类器官内异质性是由不同的转录程序编排：
预先存在的异质性定义了细胞的克隆群。此外，
非遗传可塑性增强了癌细胞的体细胞进化，从而独立于基因突变促进了肿瘤进展。
从所有主要形态学类别（4 种上皮和 3 种间充质）中分离出克隆类器官表型并进行了转录组学分析。
与亲本肿瘤类器官相比，克隆类器官表型的 PCA 显示，根据单个表型克隆和亚型，全局基因表达存在显着差异。
在增殖方面，观察到从低增殖类器官表型（囊性分支、厚分支、TEBBO）到中等（树状）和高增殖间充质类器官（分支间充质、烟花、星状）的增殖梯度。在代谢方面，上皮类器官表型表现出显着差异，囊性支链类器官具有最高的基础呼吸和 ATP 产生，而厚支链类器官更多地依赖总糖酵解来产生能量。间充质类器官表达的差异很小，星状类器官显示出其耗氧率的富集，而支链间充质类器官通过糖酵解产生更多的 ATP。间充质 PDAC 亚型中缺氧特征最丰富的表型，即星状类器官，在缺氧条件下富集到总种群的 37%，而在常氧条件下富集到 19.4% 。为了进一步验证缺氧是否是由表型诱导的，使用缺氧染色（Image-iT 绿色缺氧试剂）可视化类器官中的低氧环境，发现厚支（上皮）和星状（间充质）表型是最缺氧的。对上皮标志物 E-钙粘蛋白和间充质标志物 Vimentin 进行了染色，观察到 E-钙粘蛋白表达从囊性上皮分支类器官，通过 TEBBO 到厚分支，最终是高度间充质星状类器官表型，而波形蛋白表达显示出相反模式。
一般来说，
不同的 EMT分化状态通常与独特的自我更新能力和干性相关。
厚分支类器官在上皮亚簇内表现出最显著的多细胞结构，而树状类器官最低。对于间充质亚簇，星状类器官是最显著，而支链间充质类器官最低。综上所述，
这表明 PDAC 类器官的表型异质性受到不同转录程序表达的密切指导，这转化为不同的基础细胞功能。
图：不同类器官形态的分子和功能表征
类器官表型与不同的肿瘤细胞状态和特性相关：
人类 PDAC 可分为 2 种具有不同特征和存活率的主要分子亚型：经典型和基底型 PDAC，这两个亚型可以进一步分为至少两个子簇：A 和 B。将类器官表型的表达谱与这些分子亚型相关联时，注意到
囊性分支类器官的特征 1 （经典型-A） 和 TEBBO 类器官的特征 6 （经典型-B） 明显富集。
在间充质亚型中，
分支间充质类器官在特征 2（基底样-A）中富集，而星状类器官在特征 10（基底样-B）中富集
，这表明不同类器官表型具有不同的生物学特性。
几种类器官表型特征反映了在人类 PDAC 中观察到的不同恶性状态。
与 TEBBO 表型相关的基因在稀有细胞群 （Cluster 5） 中表达最大。烟花和星状基因在与表达高水平上皮（囊性分支、厚分支和树状）特征的群体不同，与肿瘤内 EMP 一致。
研究不同类器官表型产生的肿瘤细胞在胰腺中建立肿瘤并在体内转移的能力，将这些肿瘤细胞植入同基因背景的免疫功能正常小鼠中。
观察到肿瘤组织内管状结构的独特形态，取决于移植的类器官表型。
当通过 IF 染色分析泛角蛋白和波形蛋白的透明化整个组织的肿瘤结构时，
观察到了亲本类器官的高度保守结构。
来源于上皮 TEBBO 家族和囊性分支家族的肿瘤表现出粗分支、肿胀的管腔和末端管状结构。相反，源自厚分支家族的肿瘤表现出上皮组织减少且缺乏末端管状结构。树状家族在体内形成复杂的结构，具有多个细分支和子分支。同样，间充质类器官表型与体内肿瘤具有共同的形态学特征。分枝间充质家族产生致密的肿瘤核心，分支侵入周围组织，烟花家族形成具有许多细分支的肿瘤，星状家族产生粗的侵入分支。
原位肿瘤（植入后）建立了 41 个新的类器官系，并在体外分析了形态表型。
来自不同类器官表型的肿瘤会产生高度富集的上皮和间质亚型起源细胞表型的类器官，显示出单个类器官表型的高度稳定性和保留性 EMT 记忆。
尽管不同的类器官表型具有共同的肿瘤起始能力，但所有移植的小鼠都发展为肿瘤并表现出相似的肿瘤重量，但对转移定植的常见部位的系统组织学分析揭示了来自不同类器官表型的肿瘤的不同转移能力。在上皮类器官家族中，
树状类器官显示出最高的转移能力，而囊性分支类器官最低。
同样，在类器官的间充质家族中，
星状类器官表型产生了最强转移性。
图：类器官表型代表不同的肿瘤细胞状态，具有独特的体内生物学功能
表型亚克隆对放化疗具有明显的治疗敏感性：
PDAC类器官已被证明在转录水平上具有类器官内异质性，然而这种异质性对治疗反应的影响尚未得到详细调查。首先，将 PDAC 细胞暴露于标准护理联合化疗或放疗。
对于 PDAC 亚型，上皮 PDAC 细胞受到 FFX 化疗的强烈影响，其形成类器官的能力显著降低了 85.3%，而间充质 PDAC 类器官基本不受影响。
相比之下，
照射
（8 Gy） 对间充质 PDAC 细胞的影响更强，类器官形成能力显著降低了 89.6%，而上皮 PDAC 类器官的形成能力显著降低了 64.3%。
观察到间充质类器官的形态大多不受 FFX 处理的影响，而上皮类器官在 FFX 暴露组中表现出尺寸减小和分支缺乏。相比之下，照射导致间充质类器官的类器官结构大小和分支数量显着减少，并在清除期后恢复类器官形态。与对照相比，上皮类器官在照射后显示出更小的类器官，具有更薄和更少的分支，恢复阶段部分挽救了它们的厚度。这些结果
表明 PDAC 类器官亚型对标准护理治疗的反应和停止治疗后的快速表型再生。
用 FFX 或辐照预处理细胞，并将它们原位植入裸鼠体内。植入后14天，MRI 显示，在上皮PDAC亚型中，与对照组（376.52 mm
3
）相比，FFX（50.58 mm
3
）和8 Gy（32.43 mm
3
）预处理组的平均肿瘤体积减小。同样，与对照组（744.37
mm
3
）相比，间充质肿瘤在FFX治疗后的平均肿瘤体积略有下降（623.57 mm
3
），照射后显著下降（155.93 mm
3
）。在8 Gy的辐射后，6只患有上皮肿瘤的小鼠中有3只显示出分化的改善。
尽管体外和体内细胞毒性治疗方案都表现出取决于转录 PDAC 亚型的特异性反应，但单个类器官表型是否表现出独特的治疗敏感性。囊性支链表型的上皮类器官对两种类型的处理都敏感，并且在清除期后未能恢。处理后厚囊性/颗粒型显着降低 ，然它在 FFX 去除后迅速恢复 。TEBBO 类器官在 FFX 处理下基本保持静态，而树状类器官不受影响，甚至数量增加。这两种类器官表型都对 FFX 耐药，但对放疗敏感。粗支链表型对化疗和放疗的抵抗力最强。对于间充质亚型，观察到烟花类器官在用 FFX 处理后几乎没有受到影响，然而在放疗后显着降低。相反，支链间充质类器官受 FFX严重影响，但对辐照的抵抗力更强。星状类器官对 FFX 具有抗性，，而辐射降低了它们的相对数量并伴有团块表型的出现。综上所述，
在类器官中观察到 PDAC 亚型特异性的敏感性和对常规细胞毒性治疗的耐药性。
重要的是，
来自同一亲本 PDAC 系的确定类器官表型对治疗表现出不同的反应，并且这种反应可能因治疗类型而异。
这些发现清楚地表明，可以使用分支类器官测定将肿瘤细胞异质性功能化以研究治疗耐药性。
图：定义 PDAC 亚型和类器官表型特异性对放化疗的敏感性
表型特异性靶向治疗敏感性：
由于两种转录 PDAC 亚型中的特定类器官表型（FFX 后的 TEBBO、FFX/8 Gy 后的粗支化、FFX 下的烟花/星状和 8 Gy 后的支链间充质）显示出对常规癌症治疗的耐药性，
接下来寻求确定靶向治疗策略以消除特定的“持久性”类器官表型。
使用在临床实施的不同阶段中采用了包含 102 种化合物的药物库进行药筛。
厚分支上皮表型对AZD5153（BET/BRD4抑制剂）治疗有高度反应，表现为表型向更厚、更小甚至更分散的表型转变
，而不会降低O-SFU。相比之下，TEBBO、囊性分支和树状表型似乎在很大程度上不受AZD5153（BET/BRD4抑制剂）治疗的影响。相反，
波齐替尼（泛HER抑制剂）主要影响TEBBO和囊性分支类器官，而厚分支类器官则不受影响。
此外，KLF5抑制剂ML264对TEBBO类器官表型的影响要大得多，包括大小和末端芽形成的减少。
为了克服上皮PDAC细胞中异质性驱动的耐药性，并测试状态门控和状态靶向PDAC治疗的总体策略，
选择筛选中的两种强效药物AZD5153（BET/BRD4抑制剂）和波齐替尼（泛HER抑制剂）结合使用。
AZD5153和波齐替尼的组合治疗显示亚型向厚-小表型富集，占总体79.6%，而AZD5153或波齐替尼单药治疗分别占59.6%或42.6%。在转录组水平上，
所有模型都对AZD5153和波齐替尼组合治疗有反应，并朝着相似的表型趋同。
基因集富集分析显示，联合治疗后的上皮类器官（厚-小表型）在EMT、Myc和增殖方面富集，而对照类器官则保持了强烈的炎症、缺氧和Kras特征。
接下来关注间充质亚型，因为未分化 PDAC 患者对化疗的耐药性增加，总生存期降低。Birinapant（SMAC 模拟物）通过形态学将星状表型转变为烟花表型而不影响烟花类器官形态，对特定表型克隆产生了强烈影响。相比之下，前面提到的
波齐替尼（泛 HER 抑制剂）和Saracatinib（Src 抑制剂）对星状类器官有生长抑制作用
，但实际上消除了所有分支间充质类器官。
烟花类器官在第 10 天转变为与星状表型相对应的未成熟、相对较小的表型，强调了特定类器官表型的可塑性。
支链间充质表型对 RO5126766（双重 MEK/RAF 抑制剂）最具耐药性，用该抑制剂处理将所有表型合并为更薄、更小的支链间充质表型。
综上所述，分支类器官测定可以捕获 PDAC 形态异质性，并且
表型映射与靶向治疗的结合揭示了高度多样化的肿瘤内治疗反应以及独特的表型特异性敏感性。
上皮类器官表现出更多的异质性表型，需要联合靶向治疗作为细胞状态门控策略。相比之下，间充质类器官会塑性地改变其形态以适应治疗。
图：靶向治疗通过表型重编程降低表型异质性
功能化 PDAC 患者来源的类器官以模拟肿瘤内异质性：
接下来测试 PDAC 患者来源的类器官 （PDO），PDO 在植入小鼠后保留了基因组改变。
与原代小鼠 PDAC 细胞相比，与已建立的人 PDAC 细胞系相似，PDO 仅显示非常小的表型变异，主要形成囊性球形肿瘤类器官。
只有当与正确的基质和培养基补充相结合时，才能实现分支类器官的形成。将新创建的分支 PDO 培养基与已建立的完整 PDO 培养基进行了比较。
当在分支 PDO 培养基中培养相同的 PDO 系时，PDO 经历了导管浸润-伸长、分支和亚分支事件、微腔肿胀和聚结成连接类器官的连续腔的多个阶段。
在分支 PDO 培养基中培养的 PDO 过表达糖酵解、顶端连接、缺氧和 EMT/EMP 的特征，而在完整的 PDO 培养基条件下氧化磷酸化特征的上调。此外，PDOs 在分支条件下的基因表达程序显示细胞外基质的剧烈相互作用和重排，伴随着黏着斑的形成、ECM 受体相互作用、层粘连蛋白相互作用和 MET/受体酪氨酸激酶的信号传导。在分支 PDO 培养基中观察到的显着 EMT 诱导和 ECM 重塑伴随着基础 PDAC 亚型特征的增加。
正如在小鼠系统中所做的那样，接下来测试了分支类器官测定是否也能够在 PDAC 患者来源的模型中捕捉治疗施加压力下的表型变化，以及标准护理化疗是否影响类器官内部异质性。FFX 处理大大降低了分支能力，PDO 系 B320 无法进行形态发生或形成任何连贯的类器官结构。PDO B211 和 B250 仍然形成多细胞结构，尽管复杂性较低，只有 PDO B250 能够打破对称性并形成管状结构。将处理后 PDO 形态叠加到 MOrPHeMap 上表明类器官异质性明显降低，PDO B211 合并为一个簇，PDO B250 主要局限于两个簇，PDO B320 聚集在图谱之外，
表明持续的治疗效果和异质性的降低。
总之，
即使是相当传统的治疗方法，例如多化疗，也会对 PDO 的确定类器官表型、表型变异性和分支能力产生特定影响。
图：患者来源的类器官在基础分支 PDO 培养基中产生异质表型
小结：
作表型可塑性是指癌细胞在给定表型谱内进一步获得特性的能力。肿瘤细胞能够（重新）激活可塑性程序，以阻断或恢复到终末和反式分化过程，例如 EMT，这是致癌的关键过程。重要的是，重编程成为表型可塑性会助长肿瘤细胞的耐药性。因此，针对这种表型可塑性被认为是癌症的一个新兴标志。为了提供一个实验系统来功能化表型肿瘤可塑性和异质性，作者团队提出了
一个来自小鼠和人体组织的胰腺癌 3D 类器官模型，在形态学和分子水平上捕获整个 EMT 谱。
