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编译：微科盟公虾米，编辑：微科盟Tracy、江舜尧。
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导读
火龙果是一种著名的水果，广泛种植在热带和亚热带热带地区，其果肉颜色分为红色、白色和黄色。红肉火龙果的果肉呈暗红色，与其他品种相比，它的口感更佳，是消费者的首选。众所周知，红肉火龙果会导致腹泻，研究报告称，火龙果通过将水分吸进肠道，促进排便而引起腹泻。然而，确切的作用机制尚不清楚。本研究采用质谱法对红肉火龙果粉末中的小分子化合物进行鉴定，并采用盐酸洛哌丁胺诱导的早期便秘小鼠模型来评价红肉火龙果的疗效（图1）。我们利用16S rDNA和非靶向代谢组学技术系统揭示肠道菌群的调控特征，并鉴定与便秘相关的肠道代谢物。我们从红肉火龙果粉末中鉴定出44种新的小分子化合物，包括多种酚酸和类黄酮化合物。病理结果显示，高剂量(1000 mg/kg)红肉火龙果粉末可显著改善早期便秘肠杯状细胞的异常扩张。此外，便秘的早期代谢物会增加，如血清素和5-羟基苯酚，这些代谢物在摄入红肉火龙果粉末后恢复正常。此外，摄入红肉火龙果粉末后，与早期便秘相关的丹毒梭菌属、副萨特氏菌属等异常肠道菌群恢复到健康水平。33种血清代谢物的表达与8种肠道菌群的丰度显著相关。因此，红肉火龙果作为预防或改善早期便秘的安全食品补充剂具有潜力。
原名：
Integrated metabolic
profiles and microbial communities to reveal the beneficial effect of red
pitaya on early constipation
译名：
综合代谢组和微生物群落揭示红肉火龙果对早期便秘的作用
通讯作者单位：
湖北医药学院附属襄阳市第一人民医院
1. 红肉火龙果粉末中化学成分的定性分析
我们采用UPLC-QE-Orbitrap-MS法对红肉火龙果粉末中的主要植物化学成分进行了鉴定。红肉火龙果粉末的基峰色谱图如图2所示。在正、负离子模式下共鉴定出44种成分(表1)，所有化合物的二级碎片离子都与mzCloud和mzVault库进行匹配并初步确认。结果表明，红肉火龙果粉末中富含酚酸和类黄酮化合物。此外，红肉火龙果的多糖含量(以葡萄糖计算)为3.9 g / 100
g，总膳食纤维含量小于0.1 g / 100 g，蛋白质含量为8.8
g / 100 g，甜菜素的含量为13.45 mg/g。
图2 基于UPLC-QE-Orbitrap-MS的红肉火龙果粉末基峰离子(BPI)图谱。(A)正离子图谱。(B)负离子图谱。
表1 基于UPLC-QE-Orbitrap-MS的红肉火龙果粉末化学成分分析
2. 红肉火龙果对便秘小鼠胃肠道推进功能的影响
胃肠运输和肠道推进评估被认为是评估便秘模型和药物有效性的标准实验。胃肠运输试验结果显示，模型组小鼠首次出现黑色粪便的时间较对照组明显延迟(
p
< 0.001)。低剂量红肉火龙果粉末对便秘没有显著的逆转作用，而高剂量红肉火龙果粉末对便秘小鼠的胃肠运输功能有显著改善(图3A)。在肠道推进实验中，对照组小鼠的平均肠道推进率为90%。相反，模型组小鼠的肠道推进率显著降低，约为60% (
p
<
0.01)。然而，口服大剂量红肉火龙果粉末可显著改善便秘小鼠的肠道推进率(图3B)，与对照组相比无显著差异。
3. 组织学研究
正常结肠黏膜表面有吸收细胞和杯状细胞，固有层有吸收细胞、杯状细胞、少量干细胞和内分泌细胞。各细胞维持正常平衡，调节肠道运输功能，如图4中的对照组。一旦细胞的平衡被打破，就会发生便秘、肠癌和其他疾病。图4中的模型组和RP-L组 (红肉火龙果粉末低剂量组，200
mg/kg)小鼠结肠粘膜表面和固有层杯状细胞数量增加，吸收细胞和其他细胞数量减少，提示肠道吸收功能不足，肠道功能紊乱。然而，如图4中 RP-H组(红肉火龙果粉末高剂量组，1000 mg/kg)所示，当给予高剂量的红肉火龙果粉末(1000 mg/kg )时，过度活跃的杯状细胞恢复到其基本状态。这些结果表明，高剂量的红肉火龙果粉末可以显著改善早期便秘的症状。
图4 各组小鼠H&E结肠组织病理变化(比例尺50µm)
4. 血清代谢组学的多元统计分析
为了说明四个组的总体趋势，我们首先应用PCA模型进行数据解释。在主成分分析的基础上，我们对各组间的变异进行了分离，并根据VIP值计算出各组间的变异，以确定潜在的生物标志物。从图5A和B所示的PCA结果可以看出，在ESI
+
和ESI
−
模式下，对照组、模型组、RP-L组和RP-H组之间具有很好的分离性，结果表明，两两比较后，它们可以很容易地分离，置换检验有效（图5C-H）。
图5 正、负离子模式下PCA和OPLS-DA分析。正离子模式(A)和负离子模式(B)下各组主成分分析得分图；正离子模式(C)和负离子模式(D)下，对照组 vs 模型组的OPLS-DA得分曲线图；正离子模式(E)和负离子模式(F)下，模型组 vs高剂量组的OPLS-DA得分曲线图；正离子模式(G)和负离子模式(H)下，对照组 vs 模型组的置换检验。
5. 代谢组学分析鉴定差异代谢物
PCA分析与OPLS-DA分析结果一致。在分析代谢组学数据时，OPLS-DA的判别能力优于PCA。本研究采用有监督的OPLS-DA模型，按照VIP > 1,
p
< 0.05筛选生物标志物。我们通过数据库(https://www.hmdb.ca/)检索正、负离子的准确质荷比(m/z)，筛选出符合条件的化合物，随后再通过MS/MS的碎片裂解行为确定了可能的生物标志物。
根据VIP > 1和
p
< 0.05的标准，我们筛选出了几种代谢物作为潜在的生物标志物。通过比较对照组、模型组和红肉火龙果粉末组的小鼠血清代谢物的变化趋势，我们确定了33种代谢物为潜在代谢物。具体来说, (3R,6′Z)-3,4-dihydro-8-hydroxy-3-(6-pentadecenyl)-1
H
-2-benzopyran-1-one、5-(10,13-nonadecadienyl)-1,3-benzenediol、5-羟基苯酚、 8,15-DiHETE、12-HETE、12-KETE、13-L-hydroperoxylinoleic acid、胆酸、citbismine A、阿糖胞苷 (拓扑替康)、DL-盐酸胍、己内酰胺、4,5-二氢-3-(4-羟基苯基)-5-异恶唑乙酸甲酯、乙酸异丙烯酯、L-谷氨酸、L-组氨酸、L -脯氨酰- L -脯氨酸、N-乙酰半乳糖氨基-6-硫酸盐、烟酸单核苷酸、烟酰胺、乳清酸、PC(P-16:0/16:0)、PC(P-18:0/16:0)、对甲酚硫酸盐、植物鞘氨醇、脯氨酰-丙氨酸、血清素、牛磺胆酸、肉豆蔻酰肉碱、酪胺葡萄糖醛酸和熊去氧胆酸含量在模型组中显著上调，而6-姜酮酚和L-赤藻酮糖含量在模型组中显著下调。上述生物标志物在不同组中存在差异(图6)。
图6 红肉火龙果粉末调节的主要差异代谢物的筛选过程。两组之间差异代谢物的火山图(A：正离子模式；B：负离子模式)。上调和下调的差异代谢物(C：正离子模式；D：负离子模式)。E：对照组、模型组、RP-L组、RP-H组的代谢产物热图。
6.代谢
途径分析
为了研究主要潜在生物标志物的代谢途径，我们分析了病理条件下差异代谢物的变化(
p
< 0.05)和给药后差异代谢物的变化(
p
< 0.05)。本研究使用KEGG数据库研究了它们之间潜在的相互作用，并使用MetPA证实了这些代谢途径的影响。如图7所示，潜在生物标志物与氮、组氨酸、D-谷氨酰胺、D-谷氨酸、牛磺酸、亚牛磺酸、烟酸、烟酰胺、鞘脂、胆固醇丁酸酯、L-丙氨酸、L-天门冬氨酸、谷氨酸、谷胱甘肽、卟啉、叶绿素、色氨酸、精氨酸和脯氨酸的代谢以及初级胆汁酸和氨酰-tRNA的生物合成有关。
7. 红肉火龙果粉末可能调节早期便秘小鼠的肠道菌群
如图8A、B所示，稀释曲线、Rank Abundance曲线表明采样充分均匀，测序次数合理，可用于数据分析。小鼠粪便肠道菌群chao1指数的α多样性小提琴图显示，对照组和RP-H组肠道菌群多样性总体较高，而模型组和RP-L组肠道菌群多样性相对较小。这表明早期便秘模型显著降低了小鼠肠道菌群总数。给予高剂量红肉火龙果粉末后，小鼠肠道菌群总数明显恢复，与正常小鼠相当(图8C)。如图8D所示，对照组、模型组、RP-L组、RP-H组小鼠粪便中OTU数分别为2248、2467、2517、2696个，其中共有OTU数为1048个。对照组、模型组、RP-L组、RP-H组的独有OTU数分别为599、597、702、848个。
主坐标分析(PCoA)图用于比较微生物群落之间的β-多样性(图8D)。通过观察四组在PCoA图上的分布，我们发现模型组与对照组相比有明显的位移。此外，RP-L组和RP-H组肠道菌群组成也与对照组有显著差异，说明红肉火龙果粉末给药后对早期便秘模型小鼠肠道菌群有较大影响。我们也可以看到，RP-H组中小鼠肠道菌群恢复到与对照组相似的水平。这些结果表明，红肉火龙果粉末部分恢复了早期便秘小鼠肠道菌群的丰富度和多样性，而对肠道菌群β-多样性指标的影响有限。
图8F显示了四组的肠道菌群在门水平上的相对丰度，主要优势菌群为拟杆菌门、厚壁菌门、疣微菌门、变形菌门和脱硫杆菌门。此外，图8G显示了四组的肠道菌群在属水平上的相对丰度，主要优势菌群为未分类肠杆菌属、鼠杆状菌属、阿克曼氏菌、副杆菌属和拟杆菌属。为了进一步确定红肉火龙果粉末调节早期便秘的潜在标志菌群，如图8H和I所示，在门水平上，红肉火龙果粉末显著调节了热袍菌门、硝化螺旋菌门、芽单胞菌门、FCPU426、酸杆菌门、绿弯菌门、甲基肌酐门的丰度，这些可能被认为是门水平上的标志菌群。此外，丹毒梭菌属、副萨特氏菌属、
Clostridia_UCG-014_unclassified
、阿里叶柄菌属、双歧杆菌、
Eubacterium _coprostanoligenes_group_unclassified
和厌氧菌属可以被认为是属水平上的标志菌群，因为这些微生物可以利用红肉火龙果粉末逆转盐酸洛哌丁胺诱导的便秘。
图8 四组小鼠粪便中某些微生物菌群的存在和丰度分析。(A)稀释曲线；(B)各组的丰度排序；(C)物种积累箱形图；(D)各组小鼠粪便OTUs韦恩图；(E)基于 chao1指数的组间差异箱形图；(F)基于加权Unifrac的β多样性箱形图；(G)门水平的物种相对丰度；(H)属水平上的物种相对丰度；(I)种水平上的物种相对丰度。
8. 差异肠道菌群与差异血清代谢物的相关性分析
我们对16S rRNA基因测序分析得到的差异肠道菌群与LC-MS分析得到的差异血清代谢物之间的潜在关系进行相关性分析。包括5-羟基苯酚在内的33种主要差异代谢物和包括G组链球菌在内的8种主要差异肠道菌群数据当作Spearman相关分析的输入文件，并以热图表示(图9)。如图9所示，这些代谢物中有许多都是某些肠道菌群的共有代谢物，可以直接参与微生物代谢。一些细菌包括
g_Pseudochrobactrum
、
g_Murimonas、g_Acidiophilum
和
g_Alcaligenes
与各种代谢产物呈强正相关。6-姜酮酚的表达与
g_Pseudochrobactrum
(*0.01 <
p
< 0.05)、
g_Acidiphilium
(*0.01 <
p
< 0.05)、
g_Murimonas
(**0.001 <
p
< 0.01)、
g_Alcaligenes
(**0.001 <
p
< 0.01)等4种细菌的表达均呈极显著负相关。在盐酸洛哌丁胺诱导的早期便秘症状中，血清代谢物的表达可能受到某些肠道菌群丰度调节的影响，因此红肉火龙果粉末可能对早期便秘有一定的治疗作用。
图9 肠道菌群与血清代谢物的相关性。横坐标表示不同的肠道菌群，纵坐标表示不同的代谢物。颜色范围从红色(正相关)到蓝色(负相关)。用星号表示差异显著(*0.01 < p < 0.05， **0.001 < p < 0.01， ***0< p< 0.001)。
便秘是一种普遍的疾病，对生活质量有重大影响。便秘的定义是排便频率大大减少，大便干燥坚硬，排便困难。最新数据显示，中国成年人便秘的发生率为7～20.3%，其中女性发病率明显高于男性，且发病率随年龄增长而增加。目前常用的治疗便秘的药物主要分为溶剂型泻药、渗透性泻药、刺激性泻药、促动力药物、分泌性药物、益生菌等。尽管有许多治疗便秘的药物，但它们的使用往往伴随着许多副作用，如初期使用效果好，长期使用效果差，药物依赖，因此仍然迫切需要更有效的治疗选择。
在过去，人们发现了一些已知的缓解便秘的食物，并一直沿用至今。香蕉、西番莲、芦荟和羊栖菜等食物被公认为具有润肠通便的功效，并且对它们的通便作用进行了研究。例如，在香蕉等食物中发现的不溶性膳食纤维可以作为一种机械刺激，促进肠道运动，从而滋润肠道，促进排便。芦荟通过脱水刺激腹泻因子（如蒽醌类化合物）缓解便秘。胡萝卜中的水溶性膳食纤维经肠道菌群发酵产生有机酸等物质，刺激肠道蠕动。抗性淀粉不能被肠道吸收，可被肠道菌群分解生成短链脂肪酸，降低肠道pH值，促进肠道蠕动。猕猴桃籽含有丰富的粗脂肪和α -亚麻酸，对肠道有很强的润滑作用，也被认为是一种缓解便秘的功能性食品。从食物中获取的治疗便秘的药物已被证明疗效温和，副作用少，因此具有极其重要的开发价值。
目前，便秘的发病机制尚不清楚。研究人员认为与肠道神经系统、胃肠道Kakhar间质细胞、胃肠道激素水平异常、胃肠道神经递质改变、肠道菌群、心理因素、胃肠道平滑肌等因素有关。粪便排泄依赖于结肠的协调运动，而结肠运动障碍是引起便秘的重要机制之一。盆底肌衰弱可缩短肠道收缩时间，造成排便困难，因此盆底肌功能障碍也是便秘的机制之一。黏膜免疫调节异常可引起胃肠道黏膜功能紊乱，也可引起便秘。便秘患者可能存在肠道菌群失调，如双歧杆菌和乳酸杆菌水平下降，这也可能是便秘的机制之一。脑-肠轴的异常调节可破坏肠道运动和调节物质的分泌，导致便秘。此外，便秘与心理因素、遗传、药物使用和饮食习惯密切相关。
大量研究表明，多种兴奋性神经递质如乙酰胆碱、P物质、5-羟色胺、胃动素、胃泌素等，以及抑制性神经递质如醋酸阿肽地尔、一氧化氮、缩胆囊肽等肠道神经递质与结肠运动密切相关。其中更经典的肠道神经递质是5-羟色胺。5-羟色胺的作用机制包括促进肠道水、电解质和黏液的分泌，促进肠道蠕动，平滑肌收缩和血管收缩，改善肠壁局部血液循环。同时，胆汁酸代谢异常与便秘的发生发展有着密切的关系。胆汁酸的生物合成在减缓肠道转运中起着至关重要的作用。长时间的结肠运输导致厌氧菌数量增加，7α-羟化酶活性增强，最终引起血清胆汁酸和去氧胆酸水平升高。在本研究中，便秘模型小鼠血浆中胆酸、熊去氧胆酸、牛磺胆酸均显著升高，但它们都可以通过服用高剂量的红肉火龙果粉末来恢复到健康水平。此外，氧化应激指数失衡也是便秘的重要原因。
改善肠道活性氧和氧化应激水平可以改善便秘状态。8-羟基脱氧鸟苷是便秘患者血清氧化应激的重要标志物。大脑与肠道菌群之间的交流主要通过肠壁介导，其中胃肠道运动和肠道通透性由大脑调节，大脑对胃肠道运动和肠道通透性进行调节控制，进而影响肠道微生物群的组成和功能。此外，有研究表明，肠道菌群可影响肠道中色氨酸羟化酶2的表达，引起5-羟色胺含量的改变，进而干扰肠道局部神经反射，最终影响肠道分泌功能，促进肠运动。其他影响因素，如不规律的体育锻炼和心理状态，也可以通过多种神经调节机制引起便秘。
本研究探讨红肉火龙果粉末对盐酸洛哌丁胺所致早期便秘的缓解作用及其机制。我们通过对排便行为的观察表明，高剂量组小鼠表现出粪便中水分增加，排便更频繁，排便过程更顺畅，与对照组相似。相比之下，模型组和低剂量组小鼠均出现排便困难，粪粒数量减少，表现出一定的便秘特征。病理分析显示便秘模型组小鼠肠黏膜固有层表面杯状细胞数量明显增加。我们发现高剂量的红肉火龙果粉末可以将便秘的异常病理特征恢复到正常状态，这表明食用红肉火龙果可以显著改善肠道便秘。
血清代谢组学分析显示，模型组小鼠血清小分子代谢物5-羟基苯酚和血清素水平显著升高，与色氨酸、精氨酸和脯氨酸的代谢途径有关。5-羟基苯酚是血清素的代谢物，是一种重要的肠道神经递质，参与胃肠运动的调节。前期大量研究证实血清素参与肠道运动功能的调节，血清素表达受损与患者便秘有高度相关性。我们目前的研究发现，在早期便秘模型组中，血清素及其代谢物5-羟基苯酚增加，这一结果与前期文献结果不同。事实上，在便秘早期症状时，血清素的增加可能是机体的一种自我保护机制。因此，我们假设红肉火龙果对盐酸洛哌丁胺诱导的早期便秘的调节可能不是通过经典的血清素途径介导的。与现有报道一致，肠道菌群丹毒梭菌属和副萨特氏菌属与便秘有关。红肉火龙果还能逆转便秘小鼠肠道菌群丹毒梭菌属和副萨特氏菌属的丰度，这可能与改善肠道相关应激状态有直接关系。最近的研究表明，在功能性便秘中，肠道菌群(如肠杆菌属、克雷伯菌和阿克曼氏菌)发生了显著的变化。然而，在本研究中，我们发现只有阿克曼氏菌在洛哌丁胺诱导的小鼠中表现出明显的变化。这可能归因于真实患者与诱导动物模型之间的差异。
综上所述，红肉火龙果粉末具有通过多种途径改善便秘症状的潜力，包括对肠道微生物群和血浆代谢物的调节和影响(图10)。火龙果富含多种生物活性物质，包括黄酮类、酚类、多糖、膳食纤维和植物蛋白。膳食纤维在肠道中可以起到直接的机械刺激作用，或被肠道菌群消化发酵产生短链脂肪酸和有机酸，间接刺激肠道蠕动，消除便秘，事实上，火龙果籽中的含油量也可能在肠道中起到润滑因子的作用，可能有助于火龙果通便的作用。火龙果改善便秘的潜在机制可能涉及氮代谢、氨酰-tRNA生物合成、D-谷氨酰胺和D -谷氨酸代谢、谷胱甘肽代谢、丙氨酸,天冬氨酸和谷氨酸代谢等多种代谢途径。这些途径与血清素、5-羟基苯酚、胆酸和其他核心代谢物的代谢有关。同时，红肉火龙果已被证明可以逆转便秘小鼠肠道内丹毒梭菌属、副萨特氏菌属、
Clostridia_UCG-014_unclassified
、阿里叶柄菌属、双歧杆菌、
Eubacterium_coprostanoligenes_group_unclassified
和厌氧菌属的生态失调。研究结果表明，这些肠道微生物可能参与了红肉火龙果改善便秘的机制。8个主要差异微生物与33种核心差异代谢物的相关分析显示，
g_Pseudochrobactrum、g_Murimonas、g_Acidiphilium
和
g_Alcaligenes
与各种代谢物之间呈显著正相关。需要进一步研究来探索这些相关性的潜在机制。
图10 红肉火龙果通过调节肠道菌群和粪便、血清中与色氨酸代谢和初级胆汁酸生物合成相关的代谢物，改善盐酸洛哌丁胺诱导的小鼠早期便秘。
我们的研究证实，红肉火龙果可以缓解便秘症状。本研究中，大剂量红肉火龙果粉末可明显逆转盐酸洛哌丁胺致小鼠早期便秘的异常症状。血清代谢组学研究显示，在便秘早期，血清素及其代谢物5-羟基苯酚增加，喂饲红肉火龙果粉末后恢复到正常水平，提示红肉火龙果粉末可能通过调节5-HT（5-羟色胺）通路发挥作用。微生物组数据显示
Clostridia_UCG-014_unclassified
等菌群具有揭示红肉火龙果粉末药效学效应的潜力。综上所述，本研究为进一步探索红肉火龙果治疗便秘的作用机制提供了方向。
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38639438/
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