早期胚胎发育是生命科学领域的核心研究方向之一。胚胎从受精卵开始发育，经过基因组激活（zygotic genome activation, ZGA）、快速细胞分裂和谱系分化，最终形成囊胚，为胚胎着床及后续发育奠定基础。在这一过程中，囊胚内三谱系的形成——内细胞团（inner cell mass, ICM）、原始内胚层（primitive endoderm, PrE）和滋养外胚层（trophectoderm, TE）——标志着胚胎命运决定的关键转折点。然而，受限于胚胎样本的稀缺性和实验条件的限制，如何构建精准模拟早期胚胎发育的体外系统，仍是该领域亟待解决的科学难题。基于mTBLCs的这一特性，2025年1月17日，杜鹏课题组在Cell Stem Cell杂志在线发表了题为 Mouse totipotent blastomere-like cells model embryogenesis from zygotic genome activation to post implantation 的研究论文。在这项研究中，作者进一步优化了mTBLCs培养条件，并开发了mTBLCs自发分化和单细胞起始的类囊胚形成系统，mTBLCs-类囊胚具有EPI、PrE和TE谱系，并能进一步形成着床后阶段的卵圆柱胚样结构，重现了从ZGA至囊胚形成的完整发育过程。这一突破为研究全能性、细胞命运决定以及早期胚胎形态发生提供了新的技术平台，也为早期发育的基础与转化研究开辟了新的可能性。图1. 通过mTBLCs模拟小鼠早期胚胎发育的关键事件的模式图1:该研究通过优化培养基（2MYCP），显著提高了mTBLCs的增殖速度和长期自我更新能力，主要通过加入2-DG、Minocycline、Y-27632、CHIR-99021和PlaB等因子。在此过程中，PlaB发挥了关键作用，通过抑制剪接驱动了从多能性向全能性的转变，而Oct4基因的去除并未影响mTBLCs在2MYCP培养基中的自我更新能力，表明Oct4不是维持细胞全能性的必要条件。2MYCP培养基中，Wnt信号通路在mTBLCs中被激活，且Wnt信号通路与细胞周期、增殖通路的激活与mTBLCs的快速自我更新能力密切相关。进一步的实验结果表明，抑制Wnt信号通路可显著抑制mTBLCs的增殖，证明Wnt信号对于2MYCP培养基中mTBLCs的快速扩增至关重要，但它并不参与维持mTBLCs的全能性。2. mTBLCs具有独特的表观基因组特征，这些特征有助于其全能性维持和快速自我更新。通过ATAC-seq和CUT&Tag分析，发现mTBLCs的启动子区域（TSS）H3K27me3和H3K9me3整体水平下降，而H3K4me3、H3K27ac和RNA Pol II标记整体水平未发生显著变化，其表观特征与早期胚胎的初期胚胎细胞（如2细胞阶段）相似。此外，mTBLCs具有比PSCs更多的宽的H3K4me3域 （broad domain），以及更少的二价修饰基因（bivalent gene），且MERVL转座子在mTBLCs中具有显著的H3K4me3标记。Wnt信号通路的激活进一步增强了与细胞周期和增殖相关基因的H3K4me3富集，从而促进了mTBLCs的快速增殖。3.本研究进一步评估了mTBLCs在体内外的分化潜力。在嵌合体实验中，通过单细胞数据，捕获到了EGFP标记的mTBLCs生成的13种细胞，其中包括7个胚外谱系和6个胚内谱系，证明了其在嵌合小鼠中的双向发育潜能。此外，mTBLCs通过类胚体（EBs）和畸胎瘤实验也都展示出了胚内外双向分化潜能，产生了包括神经、心脏和肾脏等三胚层来源的细胞，也激活了包括经典滋养层标志基因，展示其能够生成胚外滋养层样谱系。总体而言，mTBLCs具有强大的双向发育潜力，能够分化为各种胚内外谱系，成为评估全能干细胞发育潜力的重要工具。4.本研究利用mTBLCs建立了一个模拟胚胎着床前发育的体外分化模型，以克服现有体外分化系统的挑战。在基础分化培养基中培养mTBLCs约3-4天后，细胞形态发生显著变化，形成了胚胎干细胞（ESC）、胚外内胚层干细胞（XEN）和滋养层干细胞（TSC）样的克隆。RNA-seq分析显示，mTBLCs在分化过程中激活了不同发育阶段的基因，经历了从早期初级基因组激活（minor ZGA）到主要基因激活（major ZGA）的转变。免疫组化验证了mTBLCs能够分化为上胚层（EPI）、胚外滋养层（TE）和原始内胚层（PrE）等谱系。单细胞RNA测序揭示，mTBLCs在分化过程中产生了涵盖2细胞、4细胞、8细胞及囊胚阶段的多种细胞类型，拟时间分析显示mTBLCs经历了两次命运决定，首次产生TE样细胞和ICM/EPI样细胞，随后ICM/EPI样细胞分化产生了PrE样细胞。研究进一步发现，在自发分化过程中，mTBLCs 还产生了Zscan4+ 和 Zscan4- 两类基因组激活样细胞（ZLCs）。拟时间分析表明，只有Zscan4- ZLCs 能够成功分化为 EPI、PrE 和 TE 三大谱系。因此，本研究提出，主要的 ZGA调控网络可能至少可以分为由 Zscan4 表达标记的两个独立部分。同时，Zscan4 的表达可能并不是进一步干细胞命运决定所必需的。这一观察结果也与人类 TBLC 的自发分化过程一致，在这一过程中，经典的 ZGA 标志基因（如 ZSCAN4/5A、DUXA/B 和 TPRX1 等）完全没有被诱导表达（详见BioArt报道：Cell | 杜鹏课题组通过剪接抑制获得两种新型人全能性干细胞）。这些发现不仅进一步证实了 mTBLCs 的内在全能性，也为探索哺乳动物胚胎发育过程中的共性机制提供了新视角。5. 此外，本研究发现，在没有任何外源性信号干预的情况下，单个mTBLC能够经历扩增、极化和压实过程，最终高效率的形成结构完整的类囊胚（blastoid）。这一类囊胚结构不仅包含内细胞团、原始内胚层和滋养外胚层等胚胎样细胞，且未见异常中间状态的细胞，mTBLC来源的囊胚在转录组上与体内囊胚更为接近，三个谱系的特定标志物富集。并且类囊胚可以在体外继续培养，发育成类似卵圆柱的后植入阶段结构。也可以将类囊胚移植到假孕小鼠中，其成功植入并形成卵圆柱样着床后胚胎结构。综上，本研究首次建立了基于 mTBLC 的自发分化和胚胎样结构形成系统，成功模拟了胚胎早期发育的多个关键环节。尤其是在细胞命运决定和全能性研究领域，这一系统为理解早期胚胎发育中的细胞命运转变提供了新的视角。此外，该研究还为胚胎发育模型的应用开辟了新的可能性，未来基于这一系统，科学家们有望深入研究胚胎发育异常的分子机制，探索病理过程，甚至为解决不孕不育等生育医学问题提供全新解决方案。杜鹏为该论文的通讯作者。北京大学生命科学学院博士后彭冰、北京大学前沿交叉学科研究院博士研究生王清仪、生命科学学院博士研究生张飞翔为本文的并列第一作者。北京大学生命科学学院博士后申辉参与了部分工作。https://www.cell.com/cell-stem-cell/fulltext/S1934-5909(24)00446-6制版人：十一
1. Shen, H., Yang, M., Li, S., Zhang, J., Peng, B., Wang, C., Chang, Z., Ong, J., and Du, P. (2021). Mouse totipotent stem cells captured and maintained through spliceosomal repression. Cell https://doi.org/10.1016/j.cell.2021.04.020.
2. Li, S., Yang, M., Shen, H., Ding, L., Lyu, X., Lin, K., Ong, J., and Du, P. (2024). Capturing totipotency in human cells through spliceosomal repression. Cell 187, 3284-3302.e23. https://doi.org/10.1016/j.cell.2024.05.010.
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