来源：绿谷制药官微
生命体都是甜的，尤其在研究糖科学的人看来更是如此。人体内含有 1000 万至 1 亿种不同的糖蛋白。
碳水化合物
（Carbohydrates ）是一种非常难以研究的分子，不过从事糖科学研究的科研人员们没有放弃，他们正在开发新型的研究手段和工具，并且积极地向其他人推广他们的新成果，希望更多的人能够更早、更快地用上这些新进展。
摄入过多的糖会让我们的腰围增大，并且带来很多健康问题，但是
从事糖生物学（glycobiology）研究的科研人员却面临另外一个难题，那就是得不到足够多的糖
。幸运的是，糖这种物质无处不在。哺乳动物细胞外就是一层 10～100 nm 厚的糖衣。我们一直认为这层糖衣就是起到保护的作用，但是美国斯坦福大学的化学及生物学家 Carolyn Bertozzi 却认为，这片由分枝状糖链组成的“森林”其实还隐藏了很多有用的信息。森林里的“窃窃私语”让 Bertozzi 和其他的糖科学家都着迷不已。
NIH 国家医学研究所生物化学及生物相关化学部门的负责人、生化学家 Pamela Marino 认为，
细胞的糖衣就好像位于细胞外部的一片生机勃勃的海洋。很多重要的生物学事件，比如细胞之间的相互识别和信号传递等，都发生在这片海洋里
。糖除了在机体能量代谢过程中起到了非常重要的作用，还在细胞外扮演了十分重要的角色，比如 O -GlcNAc 对于基因表达就有非常重要的意义。糖还与发育、感染、炎症、肿瘤，以及神经退行性疾病等诸多方面都有非常密切的关联。
美国国家医学研究所生物医学技术部门的负责人 Douglas Sheeley 认为，关于聚糖（glycans）分子在结构上的多样性，以及糖基化（glycosylation，即糖分子与蛋白质、脂质等分子结合的作用）的作用，我们已经掌握了大量的资料了。
很多细胞蛋白质在其表达、包装等过程中都是需要经过糖基化修饰的
，很多酶都会参与这个修饰过程。
糖基化修饰作用就决定了蛋白质的功能
，这也是很多科研人员非常关注的一个研究方向。
糖分子研究手段
已经相对成熟了，不过还远没有达到基因组学或蛋白质组学已经达到的那个高度。Sheeley 表示，这主要是因为
碳水化合物太难研究了
。在聚糖分子中，每一个单糖分子（mono-saccharides）都紧紧地与其它单糖分子结合在一起。而且这种结合方式多种多样，在每一个碳原子或糖环结构上都可以发生不同的结合反应。另外糖分子是分枝状的，而不像核酸是链状的，这些都是糖分子研究与 DNA 或 RNA 研究之间不同的难点所在。
从事糖分子生物学研究的实验室通常都会使用下面几种实验手段，包括
生物化学实验手段、芯片技术和质谱技术
等。但是其他非糖分子专业的实验室则往往会因为担心学习这些技术的周期太长而退缩。Bertozzi 和来自谷歌旗下的 Verily 生物科技公司的 KrishnanPalaniappan 都认为，不论是专业人士，还是非专业人士，都需要这些技术。只有这样，我们才能获取完整的
人体糖蛋白组
（human glycoproteome ）资料，并
了解哪些蛋白，在什么条件下，在哪些位点上发生了糖基化修饰
。糖分子研究人员们也非常迫切地要求技术的进步和普及，而且他们需要的是能够直接使用的技术。
哺乳动物细胞表面都覆盖着这样一片糖分子构成的森林，这些糖分子存在各种各样的结构和功能，等待着我们去发现。
糖分子研究人员们之所以那么积极地研究碳水化合物，是因为
这些糖分子扮演了多种非常重要的生物医学角色
。据 Marino 介绍，人体的粘膜（比如肺上皮组织）含有一层链状的粘液素分子（mucin），这些分子上也都结合了糖分子，比如 α2, 6 结合唾液酸（α2, 6-linked sialic acid），在鸟类中则是 α2, 3 结合唾液酸。如果禽流感病毒的结合特异性发生了改变，那么也能够结合 α2,6 结合唾液酸，然后就可以感染人类了。
病毒能够与细胞表面的糖分子结合，有些病毒甚至能够与多个糖分子侧链结合，以便更加牢固地结合在细胞上
。有一些细菌（包括人体致病菌）和细菌毒素一样，也能与糖分子结合。包括 HIV 病毒在内的很多病毒，也会利用糖分子，将其包裹在最外层，以躲避机体免疫系统的识别和攻击。
如今，实验室里已经可以根据自身需要合成出相应的基因和蛋白质了，也可以对自己感兴趣的基因和蛋白质进行测序、改造，还可以利用各种模型系统对这些分子进行研究，并且已经构建了海量的数据库。但据 Marino 介绍，糖分子研究还远远没有达到这个高度，不过他们一直在努力。
NIH 和美国国家科学基金会资助的多个项目都涉及了糖分子研究的内容；美国国家标准及技术研究院也下设了碳水化合物部门；美国国防高等研究计划署也正在准备开展一项糖科学研究项目；而由 Sheeley 和 Marino 共同领导的 NIH 日常基金也资助了大量的糖科学研究项目。在加拿大、欧洲、澳大利亚和日本，也都在开展各种糖科学研究工作。
一大批类似美国国家科学院国家研究委员会与世界各地的科研人员合作开展的路线图式研究工作，催生了新兴技术的发展，其中就包括了
碳水化合物合成和测序技术
。据 Marino 介绍，这些技术目前都已经具备了自动化的潜力。各个实验室都有他们各自的研究视角，有的实验室可能喜欢将糖蛋白降解成更小的片段，使其去糖基化修饰，通过质谱技术来开展研究，看看哪些聚糖会分离出来；也有一些实验室会通过去糖基化修饰的肽段来研究整个蛋白质；当然，还有一些实验室会从整体入手，研究整个完整的糖蛋白大分子。
多聚糖芯片
（Glycan array）是一种
高通量的研究手段
，它
有助于发现从蛋白质到微生物等多个层面上的聚糖结合方式
。据 Marino 介绍，芯片技术一直都是一个非常强大的研究手段，而且也还在不断的发展和改进之中。比如，美国加州大学圣地亚哥分校的一个课题组就正在开发一个大规模的唾液酸芯片；而美国埃默里大学的科研人员们则正在开发可以用寡聚核苷酸对多糖分子进行标记的多糖芯片。有了这种芯片，科研人员就可以利用基因组测序技术来了解糖与蛋白质的结合问题了。当然，所有这些正在开发中的新技术也并不是只为了从事糖分子研究的科研人员准备的，这些技术是为所有人准备的。
Bertozzi 等人的团队正在研究如何更方便地追踪 O -GlcNAc 糖基化修饰作用。因为如果使用古老的免疫沉淀和 western blot 方法，则会消耗大量的时间和劳力。同时，Bertozzi 等人也在开发
糖蛋白质谱研究技术和标记技术
。她们希望这些新技术有助于肿瘤分类和病理信号通路的研究工作，从而帮助解决这些工作中的糖蛋白鉴定问题。美国东弗吉尼亚医学院的科研人员就使用了 Bertozzi 实验室的技术——一项结合了质谱和糖类似物分子的技术。科研人员们锁定了前列腺癌肿瘤细胞表面的唾液糖蛋白（sialoglycoproteins），想看看在具备转移能力的肿瘤细胞和不具备转移能力的肿瘤细胞表面的这些蛋白有何差异，结果他们找到了 30 多个在可转移肿瘤细胞表面特有的糖蛋白。
糖分子能够与蛋白质的特定位点相结合。比如 N 连接多糖（N-glycans）就是与天冬氨酸（asparagine, N）结合的糖分子，而 O 连接多糖（O-glycans）则是与苏氨酸（threonine, T) 或丝氨酸（serine, S）结合的糖分子。科研人员们会使用各种不同的技术来研究糖蛋白，从而查看这些蛋白质都是在哪些情况下，在哪些位点上发生了糖基化修饰反应。
Bertozzi 和 Palaniappan 指出，用来鉴定蛋白质与糖结合的生物化学技术往往都需要人工操作的参与。
核磁共振波谱法
（NMR spectroscopy）、
液相色谱技术
（liquid chromatography）和
电泳技术
（electrophoresis）都可以用于鉴定哪些多糖与蛋白质结合的工作。但是，由于样品的复杂性，再加上其它一些因素，所以真正在糖蛋白研究的实际工作中使用这些技术难度很大。不过
液相色谱与质谱技术联用
是一个非常不错的替代方案。使用糖同系物分子（sugar analogs）进行代谢标记（metabolic labeling）并不会破坏细胞的生物学特性，但是却可以帮助科研人员分离出多糖分子，供后续的质谱分析使用。
化学实验手段还有助于解决糖基化修饰的复杂性和异质性问题，这也是目前面临的一大难题。糖蛋白是一种低丰度的、但是成份又非常复杂的混合体，因此研究人员很难得到足够量的糖蛋白进行实验分析。
蛋白质的同一个位点可以结合多种不同的糖分子，而每一个单糖分子又可以以不同的方式与蛋白质结合。
在质谱实验中我们发现，
糖分子可以抑制离子化
。Bertozzi 因此设计了另外一种标记技术来解决这个问题，那就是插入一个二溴化物（dibromide）基序。为了使糖蛋白片段更容易被辨认，科研人员们往往会用非天然的糖分子同系物来标记细胞，同时再用二溴化物标记这些非天然的糖分子同系物。Bertozzi 希望让这种标记技术变的更加简便，以便让更多的科研人员使用这种技术。
据 Thermo Fisher 科技公司的流程设计师，同时也是化学家及糖科学研究者的 Julian Saba 介绍，在蛋白质和多肽研究领域，质谱技术是最为常见的一种试验手段，但是在糖分子研究领域却不是这样。Saba 同时表示，不过他们也差不多快到那一步了。因为有越来越多的新技术正在走出实验室。在一个肽段上可以结合 2 个，甚至是 100 个糖分子。这么多的糖分子会干扰质谱信号。肿瘤细胞也会通过各种不同的方式发生糖基化修饰，而且会随着不同的情况，改变这些糖基化修饰的方式，比如在转移的情况下。因此，
科研人员们需要同时了解蛋白质和糖分子这两方面的信息
。
出于好奇，Saba 也非常关注 PRIDE 等公共蛋白质组学数据库中储存的原始质谱数据。结果他发现，在肿瘤细胞的蛋白质里，有 2～20% 的数据都是糖基化相关数据，但是这些数据都很难解读，所以也很少有解读得比较好的数据。哪怕在靶向实验中，糖蛋白多肽离子也都非常少，很难产生质量比较高的数据信号，而且与其它非糖基化修饰的多肽信号相比，这些糖蛋白多肽离子的信号强度也要弱很多。
大部分质谱仪都是通过
碰撞激活解离
（collision-activated dissociation, CAD）的方式来使样品离子化的。但是 Saba 介绍，
这种离子化方式会使糖分子解离得更加彻底，打断糖分子与蛋白质分子之间的结合键
，这样一来，我们就无法得知哪些蛋白质才是发生了糖基化修饰的蛋白质了。所以，我们
需要有一套专门的、针对糖蛋白的样品制备流程、样品富集策略和数据分析软件
。可惜的是，哪怕是在最专业的糖分子研究实验室里也缺少上述这些条件。在 Thermo Fisher 科技公司里，糖蛋白组学研究的业务量也只能在质谱分析工作里排名第三。排前两名的分别是多肽鉴定和蛋白质组学定量分析业务。
Saba 还指出，酶可以帮助我们释放出多糖分子，但同时也会妨碍整个研究工序。当使用 PNGase F 等酶使糖分子从糖蛋白上解离下来的时候，与糖分子结合的天门冬酰胺（asparagine）就会转变成天冬氨酸（aspartic acid）。这就会产生大约 0.98 的质量漂移（mass shift），从而让科研人员以为发生了脱酰氨基作用（deamidization），这就说明该肽段是一个糖基化修饰的肽段。可问题在于，在样品制备过程中使用的试剂也会带来同样的脱酰氨基作用，因此，Saba 建议不要使用酶来分离糖分子，他建议不要去掉糖蛋白上的那些糖分子，因为这样会丢失很多与糖分子有关的重要信息。电子转移解离技术（electron-transfer dissociation, ETD）等样品解离技术，以及相关的多肽解离技术都可以很好地保留这些糖分子。
Saba 继续补充，如果希望使用质谱技术对糖分子进行更加精细的研究，也是非常困难的。当糖分子与蛋白质结合之后，质谱仪也无法解析其结构，因为质谱仪不能分析单糖分子之间的化学键。此时，如果将糖分子从糖蛋白上解离下来，就会容易得多。因此，
如果要研究糖分子的复杂性问题，质谱技术并不是一个应用范围非常广的选择
。在多肽链中，3 个氨基酸分子就可以有 6 种不同的结合方式，但是 3 个单糖分子却可以有 2 万种不同的结合方式。Saba 的团队正在设计一个更容易操作的糖科学研究流程，以便将来条件成熟时用于开展糖蛋白质组学研究工作。
