乳酸化应该算是近几年来比较热的研究方向了,但这篇浙江大学的博士生发表在50.5分的Nature主刊上的乳酸化及先天免疫研究,算是量大管饱,做得十分详尽了。这篇文章其实着眼点就是cGAS的乳酸化分析(cGAS-STING信号通路的话,应该大家都熟悉了,通过外源dsDNA激活cGAS,然后产生下游的连锁反应激活炎症相关信号通路,不熟悉的话,可以去看看《信号通路是什么鬼》系列),这篇文章中对于cGAS为何产生了乳酸化,乳酸化导致的结果都做了详尽的揭示:
首先他们发现,在HCMV(人巨细胞病毒)感染患者中,血清L-乳酸水平正常的患者的cGAMP和IFNβ浓度,要比H-Lac(高L-乳酸水平)或LA(L-乳酸酸中毒) 的患者显著升高。也就是说细胞内的乳酸很可能会抑制免疫相关细胞因子以及cGAMP的表达,细胞因子大家好理解,为啥要测cGAMP呢?因为cGAMP是外源感染后外源dsDNA激活cGAS的产物,也就是说L-乳酸很可能会通过抑制cGAS从而抑制免疫相关的细胞因子。那么HCMV感染的患者中的乳酸,是哪里来的呢?有两个途径,一个是通过LDHA(乳酸脱氢酶)产生的,另一个是通过MCT1(单羧酸转运蛋白1)转运入细胞的。他们通过Cre-LoxP系统分别特异性敲除了骨髓源细胞中的MCT1和LDHA(Cre-LoxP系统就是通过重组酶的特异性表达,来进行特异性敲除或敲入的技术,不清楚的话,可以去看看《列文虎克读文献》,都介绍过),然后分析cGAS转换cGAMP的活性,结果发现MCT1与cGAS活性密切相关,也就是说导致cGAS失活的乳酸,应该是通过MCT1从细胞外转运进入细胞的:
转运进入细胞的乳酸,通过乳酸化抑制了cGAS的活性。那么具体是什么样的蛋白导致了cGAS的乳酸化呢?于是他们通过一轮CRISPR筛库(CRISPR筛库就是通过建立sgRNA文库,然后高通量敲除基因,并进行基因功能筛选的技术,这个在《列文虎克读文献》里也介绍过,可以去看看),发现了相关的酶AARS1/2,AARS1/2可以编码II类氨酰基-tRNA合成酶 ,可催化L-丙氨酸与tRNA的结合。通过AARS1/2与乳酸的结合发现,AARS1/2的确能结合乳酸。而对于蛋白的乳酸化,又会被AARS1/2的敲减缩抑制。由此可以清楚,AARS1/2参与了蛋白中赖氨酸的乳酸化:
AARS1/2对于丙氨酸的转换并结合tRNA,需要依赖于ATP与丙氨酸产生丙氨酸-AMP,于是他们首先对于AARS1/2结合丙氨酸-AMP的位置进行了L-乳酸-AMP的分子对接,结果发现的确能结合L-乳酸-AMP。也就是说AARS1/2是否催化L-乳酸进行乳酸化,可能也需要ATP的参与。为了验证这个步骤,他们构建了AARS1/2的ATP结合突变体,去除了ATP结合位点(这其实也是柯霍氏法则的验证过程,通过突变掉ATP结合位点,来验证ATP结合对于AARS1/2乳酸化功能的重要性和依赖性,也能有效避免肯定后件的逻辑谬误,不清楚柯霍氏法则的话可以看看《轻松的文献导读》,不熟悉肯定后件的话,可以看看《列文虎克读文献》、《信号通路是什么鬼?》系列和《科研的推理和逻辑》),结果显示AARS1/2催化L-乳酸与赖氨酸偶联,是需要依赖于ATP的:
通过进一步分别对于AARS1和AARS2的敲减,他们发现AARS2是cGAS乳酸化的关键,而cGAS的乳酸化,会导致cGAS的失活,抑制先天免疫:
看似这部分验证没啥,但其实他们在这一部分验证中,做足了功夫。首先是为了模拟cGAS的乳酸化,他们专门做了个在cGAS合成的过程中掺入乳酸化赖氨酸模型,使得cGAS在合成过程中直接乳酸化,然后再进一步分析其功能。为了确定cGAS乳酸化后引发的反应,他们又分析了乳酸化的cGAS的LLPS(液液相分离)情况。结果发现在加入dsDNA后cGAS形成的液滴(为啥在这里要加上dsDNA呢,因为大家如果熟悉《信号通路是什么鬼?》系列中cGAS-STING信号通路的话,应该清楚,cGAS是通过感应结合dsDNA,才能激活其产生cGAMP活性的,不熟悉的话可以去复习下),要比乳酸化的cGAS要大。也就是说乳酸化可能会影响cGAS对于DNA的结合,从而导致cGAS的LLPS被破坏,这也就可能是造成了cGAS失活的关键:
乳酸化可以消除cGAS对于外源dsDNA的识别,也就间接阻碍了cGAS-STING信号通路造成的炎症反应通路的激活。那么乳酸既然是外源摄入的,阻碍了细胞的MCT1,也就阻止了细胞对于乳酸的摄入。于是他们通过MCT1的抑制剂AZD阻断了MCT1,激活恢复了cGAS的功能:
最后他们在临床上,分析焦虑障碍中的cGAS的乳酸化情况。形成了这样的示意图(其实每一张Figure上他们都有示意图,这里就拼了一下),AARS2通过结合ATP和乳酸,形成了乳酸-AMP的中间结构,在通过乳酸-AMP结合赖氨酸,导致赖氨酸的乳酸化。cGAS的乳酸化,会使得cGAS结合dsDNA的能力减弱,导致cGAS无法被激活并产生cGAMP,使得先天免疫被抑制。而乳酸进入细胞内,是需要通过MCT1转运的,抑制MCT1则能有效抑制cGAS的乳酸化:
这篇文章在各个方面,对于乳酸化的验证,都是相当严谨的。甚至分析了cGAS在乳酸化后,引发的进一步功能障碍的原因,这个其实算是比较不可多得的了。好了,今天就先策到这里吧,有兴趣的话可以看看原文,祝你们心明眼亮。
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