乳酸化应该算是近几年来比较热的研究方向了，但这篇浙江大学的博士生发表在50.5分的Nature主刊上的乳酸化及先天免疫研究，算是量大管饱，做得十分详尽了。这篇文章其实着眼点就是cGAS的乳酸化分析（cGAS-STING信号通路的话，应该大家都熟悉了，通过外源dsDNA激活cGAS，然后产生下游的连锁反应激活炎症相关信号通路，不熟悉的话，可以去看看《信号通路是什么鬼》系列），这篇文章中对于cGAS为何产生了乳酸化，乳酸化导致的结果都做了详尽的揭示：
首先他们发现，在HCMV（人巨细胞病毒）感染患者中，血清L-乳酸水平正常的患者的cGAMP和IFNβ浓度，要比H-Lac（高L-乳酸水平）或LA（L-乳酸酸中毒） 的患者显著升高。也就是说细胞内的乳酸很可能会抑制免疫相关细胞因子以及cGAMP的表达，细胞因子大家好理解，为啥要测cGAMP呢？因为cGAMP是外源感染后外源dsDNA激活cGAS的产物，也就是说L-乳酸很可能会通过抑制cGAS从而抑制免疫相关的细胞因子。那么HCMV感染的患者中的乳酸，是哪里来的呢？有两个途径，一个是通过LDHA（乳酸脱氢酶）产生的，另一个是通过MCT1（单羧酸转运蛋白1）转运入细胞的。他们通过Cre-LoxP系统分别特异性敲除了骨髓源细胞中的MCT1和LDHA（Cre-LoxP系统就是通过重组酶的特异性表达，来进行特异性敲除或敲入的技术，不清楚的话，可以去看看《列文虎克读文献》，都介绍过），然后分析cGAS转换cGAMP的活性，结果发现MCT1与cGAS活性密切相关，也就是说导致cGAS失活的乳酸，应该是通过MCT1从细胞外转运进入细胞的：
转运进入细胞的乳酸，通过乳酸化抑制了cGAS的活性。那么具体是什么样的蛋白导致了cGAS的乳酸化呢？于是他们通过一轮CRISPR筛库（CRISPR筛库就是通过建立sgRNA文库，然后高通量敲除基因，并进行基因功能筛选的技术，这个在《列文虎克读文献》里也介绍过，可以去看看），发现了相关的酶AARS1/2，AARS1/2可以编码II类氨酰基-tRNA合成酶 ，可催化L-丙氨酸与tRNA的结合。通过AARS1/2与乳酸的结合发现，AARS1/2的确能结合乳酸。而对于蛋白的乳酸化，又会被AARS1/2的敲减缩抑制。由此可以清楚，AARS1/2参与了蛋白中赖氨酸的乳酸化：
AARS1/2对于丙氨酸的转换并结合tRNA，需要依赖于ATP与丙氨酸产生丙氨酸-AMP，于是他们首先对于AARS1/2结合丙氨酸-AMP的位置进行了L-乳酸-AMP的分子对接，结果发现的确能结合L-乳酸-AMP。也就是说AARS1/2是否催化L-乳酸进行乳酸化，可能也需要ATP的参与。为了验证这个步骤，他们构建了AARS1/2的ATP结合突变体，去除了ATP结合位点（这其实也是柯霍氏法则的验证过程，通过突变掉ATP结合位点，来验证ATP结合对于AARS1/2乳酸化功能的重要性和依赖性，也能有效避免肯定后件的逻辑谬误，不清楚柯霍氏法则的话可以看看《轻松的文献导读》，不熟悉肯定后件的话，可以看看《列文虎克读文献》、《信号通路是什么鬼？》系列和《科研的推理和逻辑》），结果显示AARS1/2催化L-乳酸与赖氨酸偶联，是需要依赖于ATP的：
通过进一步分别对于AARS1和AARS2的敲减，他们发现AARS2是cGAS乳酸化的关键，而cGAS的乳酸化，会导致cGAS的失活，抑制先天免疫：
看似这部分验证没啥，但其实他们在这一部分验证中，做足了功夫。首先是为了模拟cGAS的乳酸化，他们专门做了个在cGAS合成的过程中掺入乳酸化赖氨酸模型，使得cGAS在合成过程中直接乳酸化，然后再进一步分析其功能。为了确定cGAS乳酸化后引发的反应，他们又分析了乳酸化的cGAS的LLPS（液液相分离）情况。结果发现在加入dsDNA后cGAS形成的液滴（为啥在这里要加上dsDNA呢，因为大家如果熟悉《信号通路是什么鬼？》系列中cGAS-STING信号通路的话，应该清楚，cGAS是通过感应结合dsDNA，才能激活其产生cGAMP活性的，不熟悉的话可以去复习下），要比乳酸化的cGAS要大。也就是说乳酸化可能会影响cGAS对于DNA的结合，从而导致cGAS的LLPS被破坏，这也就可能是造成了cGAS失活的关键：
乳酸化可以消除cGAS对于外源dsDNA的识别，也就间接阻碍了cGAS-STING信号通路造成的炎症反应通路的激活。那么乳酸既然是外源摄入的，阻碍了细胞的MCT1，也就阻止了细胞对于乳酸的摄入。于是他们通过MCT1的抑制剂AZD阻断了MCT1，激活恢复了cGAS的功能：
最后他们在临床上，分析焦虑障碍中的cGAS的乳酸化情况。形成了这样的示意图（其实每一张Figure上他们都有示意图，这里就拼了一下），AARS2通过结合ATP和乳酸，形成了乳酸-AMP的中间结构，在通过乳酸-AMP结合赖氨酸，导致赖氨酸的乳酸化。cGAS的乳酸化，会使得cGAS结合dsDNA的能力减弱，导致cGAS无法被激活并产生cGAMP，使得先天免疫被抑制。而乳酸进入细胞内，是需要通过MCT1转运的，抑制MCT1则能有效抑制cGAS的乳酸化：
这篇文章在各个方面，对于乳酸化的验证，都是相当严谨的。甚至分析了cGAS在乳酸化后，引发的进一步功能障碍的原因，这个其实算是比较不可多得的了。好了，今天就先策到这里吧，有兴趣的话可以看看原文，祝你们心明眼亮。
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