环状RNA（CircRNAs）是一类通过反向剪接形成的5’端与3’端共价连接的RNA分子
[1]
。长期以来，环状RNA被认为是细胞内mRNA错误剪接的副产物
[1]
。然而，后续研究发现，环状RNA在体内具有重要的调控功能，且含有内部核糖体进入位点（IRES）的环状RNA能够进行翻译
[1, 2]
。2018年，Daniel Anderson等人首次证实体外合成的环状RNA 能够在真核细胞中稳定且高效地表达蛋白质
[4]
。本文将带您深入了解环状RNA的特点、功能、生物医学应用及其体外合成策略。
1.丰富性（Abundance）：
CircRNAs的表达丰度差异显著，广泛存在于人体细胞中。大多数环状RNA在细胞浆中富集，其丰度有时甚至超过相应线性mRNA的十倍以上。
2.稳定性（Stability）：
CircRNAs呈闭合环状结构，对RNase R和其他核酸外切酶具有抗性。
3.特异性（Specificity）：
CircRNAs的翻译依赖于特定的序列，因此具有组织特异性和发育阶段特异性。
4.保守性（Conservation）：
大多数CircRNAs在进化过程中高度保守，具有一定的序列保守性。
环状RNA（CircRNAs）作为一类重要的生物大分子，在体内具有多方面的功能
[5]
（图1）：
1. 转录调控
CircRNAs可以在其合成位点与宿主基因结合，并通过形成RNA-DNA杂交体（R环结构）引起转录暂停或终止，以跳过外显子或截短的转录本。
2. 竞争性内源性RNA
CircRNAs可以通过吸附microRNA（miRNA）来调节其他基因的表达。这种作用类似于“海绵”，CircRNAs吸附miRNA，从而减少了miRNA对其他靶向基因的调控。
3．蛋白质相互作用的协同作用
CircRNAs还可以结合蛋白质，形成复合物，从而影响细胞内的信号传导和基因表达。这些复合物可能在细胞周期、细胞分化和其他生物学过程中发挥着重要作用。
4．编码功能
一些CircRNAs自身具有翻译能力，可以被翻译成蛋白质。虽然这种现象相对罕见，但它为CircRNAs赋予了更多功能。
相比较于线性RNA，环状RNA具有明显的优势。首先环状RNA不容易被核酸酶降解，因此在细胞内存在更长的寿命；其次环状RNA的环状结构使其免疫原性较低，这意味着它们不容易被免疫系统识别并攻击。因此，环状RNA被广泛应用于生物医学上
[5]
，其具体应用包括(图2)：
-
环状RNA适体可以招募荧光传感器和有效的代谢物生物传感器，因此它可以作为
RNA荧光探针
和
细胞内通路调节剂
。
-
环状RNA可以充当
miRNA海绵
。环状RNA可以隔离疾病相关的miRNA，从而抑制其对miRNA靶向mRNA的生物可及性。
-
环状RNA还可以充当
蛋白质海绵
。含有Pumilio (PUM)应答元件(PREs)的环状RNA在调节细胞蛋白活性中起着Pumilio海绵的作用。
-
针对Covid - 19基因组保守区域的反义RNA工程化的环状RNA
充分抑制病毒传播
；或者靶向mRNA招募ADAR
进行可编程RNA编辑
。
-
环状RNA是一种
先天免疫反应激动剂
。自剪接产生的RNA环触发细胞RIG-I表达和PKR激活，诱导先天免疫级联反应。
-
环状RNA也是一种
先天免疫反应抑制剂
。含有短dsRNA区域的RNA环缺乏细胞免疫原性，是参与先天免疫反应的PKR的有效抑制剂。
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可作为
mRNA疗法的补充
。研究表明环状RNA具有延长表达方面的潜力。
-
环状RNA可以作为
生物标志物
。靶向病理或与疾病相关的环状RNA具有临床潜力；一些环状RNA本身可以作为诊断性生物标志物
1. T4连接酶法
来源于T4噬菌体的多种连接酶都可以催化RNA环化反应（图3），这些酶包括T4 DNA连接酶（T4 Dnl）、T4 RNA连接酶1（T4 Rnl 1）和T4 RNA连接酶2（T4 Rnl 2）。
此方法更适用于短片段的环化，对于长片段效果不佳。
图3：酶连接策略(来源[3])
2. 核酶法
1) I型内含子自剪接系统
目前最常用的体外PIE（permuted introns and exons）系统连接法是根据I型内含子自剪接的特点构建的。通过体外转录反应合成出前体RNA（Precursor RNA），然后在镁离子和GTP存在下，发生两次酯交换反应（double transesterification reactions），形成CircRNAs
[4]
。图4为基于鱼腥藻tRNA基因设计的PIE结构，通过添加辅助剪切序列，可实现长达5 kb序列的环化。通过该方法制备的CircRNAs可以通过HPLC有效地纯化，并能产生大量的蛋白质
[4]
。
但是该方法会导致circRNAs中残留非功能序列，约180bp，可能会增加免疫原性以及带来其他未知风险。
2) II型内含子自剪接系统
II型内含子体外制备CircRNAs的原理如图5所示，该系统利用破伤风杆菌Ⅱ型内含子的自催化剪接反应制备环状RNA，通过合理设计序列，该系统可以做到无外源序列残留的环状RNA制备
[6]
，但制备效率有待提高。
图5：II型内含子体外制备CircRNAs示意图 (来源 [6])
金斯瑞开发了两种自主知识产权RNA环化技术，破除海外专利壁垒，提供更优circRNAs分子，助力科研突破：
