一篇文章有多优秀，夏老师是经常给你们讲的。但有的文章，即使分很高，但还是有很多缺陷。文章的缺陷，概括起来其实就是逻辑问题。就比如今天要讲的这篇中山大学第七附属医院，发表在27.7分的Mol Cancer上的文章，讲的是外泌体circRNA诱导巨噬细胞极化。我们首先看看标题：
这篇文章的标题中其实已经给我们看到了几点信息了：1）外泌体，2）circRNA，3）miRNA，4）STAT6，5）轴，6）巨噬细胞极化，7）肿瘤。其实看完这些，大概就知道讲的是什么了，第一反应就是要做ceRNA（也就是共表达RNA，这个在《实验万事屋》里介绍过大概的原理，其实就是竞争性结合miRNA从而达到共表达的目的。这样的课题，其实如果验证得当，涉及合理，应该是很出彩的，但如果不注重课题的设计，肯定会导致肯定后件的逻辑谬误，不清楚肯定后件的话可以去看看《列文虎克读文献》和《信号通路是什么鬼？》系列）：
他们首先要论证的是外泌体的存在，以及外泌体中富含的circRNA，通过对外泌体的测序，他们找到了高表达的circRNA。那么这个circRNA对肿瘤表型是否有影响呢？他们接着进行了敲除circRNA的敲除分析：
这里的Figure解释了通过敲减circRNA发现了对肿瘤的增殖及迁移侵袭能力的影响，但过表达circRNA对肿瘤细胞的影响，放在了补充资料里。其实这里过表达circRNA的影响应该是比较重要的，通过这个验证，可以说明circRNA本身对于肿瘤细胞的作用（其实也就是所谓柯霍氏法则的验证，通过敲除或过表达circRNA，分析其具体的表型。而单独的缺失，其实很难说明问题，不清楚柯霍氏法则可以去看看《轻松的文献导读》和《列文虎克读文献》）。既然是外泌体中高表达的circRNA，他们就假设这个circRNA在外泌体中，可以影响肿瘤微环境中巨噬细胞的变化，也就是巨噬细胞的极化情况。通过在肿瘤细胞中过表达circRNA后，收集外泌体，然后与M0巨噬细胞共培养后发现，含有circRNA的外泌体可以激活巨噬细胞的M2极化：
M2极化的巨噬细胞，其实起到的是一个免疫抑制的作用，可以通过JAK-STAT信号通路被激活（不清楚JAK-STAT信号通路的话，可以去看看《信号通路是什么鬼?》系列，复习下）。JAK-STAT信号通路中STAT3和STAT6都是关键的转录因子，他们发现含有circRNA的外泌体能影响STAT6的激活，而非STAT3。他们同时发现肿瘤组织中以及微环境的M2极化巨噬细胞中，STAT6的表达都是有所增加的：
于是接着，既然已知STAT6和circRNA与M2极化有关，他们就要构建这样一个circRNA→miRNA→STAT6的轴。要建立这样一个轴，就需要找到这个中间的miRNA。他们通过筛选找到了这么一个miRNA，既能结合circRNA，也能结合STAT6的3'UTR。他们发现过表达circRNA后，这个miRNA表达下调（说实话，如果circRNA也同时能调控miRNA的转录，也会有这样的效果，仅仅是表达的证据，其实不够严谨）：
接着，为了确定circRNA→miRNA→STAT6轴的成立，他们通过Pulldown，分析circRNA→miRNA和miRNA→STAT6的结合关系，并通过过表达和敲减抑制来进行表达分析。实际上这就是这篇文章逻辑缺陷的所在，为什么呢？因为这里就存在着肯定后件的逻辑谬误（由于这部分论证的命题在于circRNA→miRNA→STAT6轴中的两两结合，这里如果验证，必须是通过对于结合位点的突变，然后查看后期表型，比如STAT6的磷酸化等情况，这里他们忽略了circRNA或miRNA过表达或者抑制会造成的其他途径的影响，光看表达的话就有点倒果为因了。不清楚这样的逻辑缺陷的话，可以去看看《列文虎克读文献》和《信号通路是什么鬼？》系列）：
这里的验证，应该是围绕着circRNA→miRNA→STAT6轴的结合而进行的，也就是如果circRNA→miRNA无法结合的条件下过表达circRNA，则无法使STAT6的表达产生变化。同样，miRNA→STAT6的结合产生变化，过表达过表达circRNA，也无法使STAT6的表达产生变化。通过将整个circRNA→miRNA→STAT6轴产生断裂，来分析下游表型，这样才能更严谨。而不是用简单粗暴的Inhibtor……
接着他们进行了进一步的实验，其实这里他们想做成Crosstalk，也就是通过circRNA外泌体处理的巨噬细胞，来对肿瘤细胞产生一定的影响。通过共培养发现，用circRNA外泌体处理的巨噬细胞，与肿瘤细胞共培养，可以促进培养基中M2极化的巨噬细胞细胞因子分泌，促进肿瘤细胞的迁移：
最后他们通过敲减circRNA来进行了小鼠的体内实验，发现的确能影响肿瘤的增殖以及抑制巨噬细胞的M2极化：
这篇文章总的来说工作量还好，但缺点其实也挺明显的，就是没有把circRNA→miRNA→STAT6这个轴验证清楚。这其中的逻辑缺陷，你们能明白么？是不是应该好好复盘一下呢？好了，今天就先策到这里吧，有兴趣的话，可以看看原文，祝你们心明眼亮。
喜欢夏老师讲文献的话，可以点点星标，点点赞，点点“在看”，多分享多转发。
公众号回复“公克”，没事可以翻翻精华帖，里面有不少宝藏工具，当作是科研过程中的一种调剂也是不错的选择哦，科研并不一定要这么无聊又尴尬：
目前夏老师已正式出版10本书，想要的可直接点以下微店小程序直接购买：
