有那么一本综合性期刊，比肩Nature Communications（NC）、Science Advances（SA），稳坐中科院一区Top，且与发一篇NC会笑醒的含金量一样，曾经，发一篇该刊也是可以吹一辈子”的~该刊就是百年老刊——PNAS。
今天咋们就看一篇该刊上顶流“糖酵解”相关文章~文章是浙江大学生命科学学院易文/朱强团队在PNAS上在线发表的研究论文。研究通过O-GlcNAcylation连接了肿瘤细胞的有氧糖酵解和免疫逃逸两个关键特征，为理解肿瘤如何在代谢和免疫层面上适应和生存提供了新视角；提出了通过阻断ENO1的O-GlcNAcylation来增强PD-L1单克隆抗体治疗效果的新策略，为结直肠癌的免疫治疗提供了新的潜在靶点和治疗思路；不仅停留在基础科学层面，还进一步探讨了ENO1 O-GlcNAcylation在人类结直肠癌样本中的表达情况，将基础研究与临床转化丝滑结合。
糖酵解作为当今国自然的顶流方向，目前也算是火的一塌糊涂，联合一些发文利器（机器学习、单细胞分析、空间转录组分析等）发高分也是小菜一碟，如果你有兴趣的话可以戳戳下方找生信塔帮你定制相关思路哦~
杂志：PNAS
发表时间：2024年10月
研究背景
结直肠癌细胞具有高速率代谢葡萄糖和逃避免疫监视的特征，但这两个特征在分子水平上的联系尚不清楚。研究显示，重要的糖酵解酶ENO1在结直肠癌细胞中被O-GlcNAc动态修饰，这种修饰在促进肿瘤生长中扮演双重角色。ENO1的O-GlcNAc修饰通过不同的糖基化位点同时调节有氧糖酵解和免疫逃避，但其具体机制尚待阐明。
研究思路
研究主要结果
1.ENO1通过其酶活性促进CRC的生长
免疫组化（IHC）显示与TCGA数据库中的分析结果一致，结直肠癌组织中ENO1的表达水平显著高于对应周围组织。使用shRNA敲低ENO1表达，发现ENO1的敲低能够抑制HCT-116和RKO细胞的增殖，过表达ENO1能够恢复细胞增殖。体外酸性化率（ECAR）测定显示，ENO1的敲低显著降低了ECAR，而过表达野生型ENO1能够恢复ECAR，表明ENO1的酶活性对细胞糖酵解和增殖至关重要。
将敲低ENO1的HCT-116细胞注射到裸鼠中，发现ENO1的敲低抑制了肿瘤生长和Ki67表达，而过表达野生型ENO1（而非S40A突变体）能够恢复肿瘤生长。
2.ENO1 T19上的O-糖基化增强其酶活
通过质谱分析确定了ENO1上的四个可能的O-GlcNAcylation位点（T19，T26，S27和S249）。分别构建T19A、T26A、S27A和S249A突变体进行化学酶标记实验，发现T19A和S249A突变显著降低了ENO1的O-GlcNAcylation信号，表明T19和S249是ENO1上的主要O-GlcNAcylation位点。
酶活性测定显示，T19位点的O-GlcNAcylation增强了ENO1的酶活性，而S249位点的O-GlcNAcylation则没有显著影响。酶动力学研究发现，在OGT过表达的情况下，WT和S249A ENO1产生2-p-甘油的最大速度（Vmax）都比T19A ENO1高得多。免疫共沉淀实验发现T19位点的O-GlcNAcylation促进了ENO1的寡聚化，从而增强了其酶活性。
3.ENO1在T19位点的O-GlcNAcylation促进糖酵解和结直肠肿瘤生长
液相色谱-质谱（LC-MS）分析显示，OGT过表达在WT ENO1重组细胞中增加了葡萄糖摄取、乳酸和ATP产生，并提高了细胞外酸化率（ECAR），而T19A突变型ENO1重组细胞中这些效应较弱。细胞增殖和集落形成实验发现，ENO1 WT重组细胞显示出比T19A突变型ENO1重组细胞更强的细胞增殖和集落形成能力。将ENO1 WT和T19A突变型ENO1在免疫缺陷裸鼠中皮下注射，发现在裸鼠模型中，ENO1 WT重组细胞形成的肿瘤比T19A突变型ENO1重组细胞更大，表明ENO1的O-GlcNAcylation在肿瘤生长中起着关键作用。ENO1的O-GlcNAcylation在T19位点的修饰增加了细胞增殖和肿瘤生长，这与增强的糖酵解活性相关。
4.ENO1在S249位点的O-GlcNAcylation通过抑制STUB1与PD-L1的结合来抑制PD-L1降解
通过AlphaFold2预测和点突变分析，发现ENO1上的E250残基对与PD-L1的相互作用至关重要。免疫共沉淀实验显示，O-GlcNAcylation在S249位点的修饰减少了ENO1与PD-L1的相互作用，导致PD-L1蛋白水平上升。通过加入蛋白合成抑制剂（如CHX）和不同降解途径的抑制剂（如MG132、chloroquine和3-MA），发现S249位点的O-GlcNAcylation通过减少ENO1与PD-L1的相互作用，降低了PD-L1与E3泛素连接酶STUB1的结合，从而抑制了PD-L1的泛素化和蛋白酶体降解。O-GlcNAcylation在S249位点的修饰增加了PD-L1的稳定性，这与PD-L1 mRNA水平无关，表明这是一种转录后调控机制。（PS：AlphaFold2预测是需要服务器来做的，有需要的朋友联系生信塔~）
文章小结
好了，由于篇幅有限，咋们今天就说到这儿，这篇文章揭示了ENO1的O-GlcNAcylation在结直肠癌中的双重作用，即通过T19位点增强ENO1的糖酵解活性，通过S249位点促进PD-L1的稳定性，从而在促进肿瘤生长和免疫逃逸中发挥作用。未来咋们可以从这2个方向进行选题：一来深入研究O-GlcNAcylation在其他肿瘤细胞中对代谢酶的修饰及功能影响，探索其调控肿瘤微环境免疫细胞功能的机制；二来针对O-GlcNAcylation相关酶（如OGT、OGA）开展小分子抑制剂研发，联合免疫治疗研究其在肿瘤治疗。朋友们快快看下你的课题能否结合进去吧~最后再提一句，生信塔团队干湿结合、临床科研、生信分析，都是行家里手！有需要的朋友欢迎联系哦~
生信塔公众号持续为大家带来最新生信思路，更多创新性分析思路请点击往期推荐，快来查看吧！想复现这种思路或者定制更多创新性思路欢迎直接call生信塔，我们团队竭诚为您的科研助力！
