研究内容和方案中的这个“瑕疵”，是国自然专家共识中最常见的差评之一！

关于体内（动物）实验中 X 基因的下调、过表达的干预手段，你一般会选用什么实验方法呢？

这个是国自然研究内容、方案中需要仔细斟酌的一环。

来看看被毙的标书评审意见中，专家是怎么说的吧。

案例 1 ：尾静脉注射，如何保证特异性作用？

案例 2 ：尾静脉注射干预某基因的表达，如何保证特异性？

案例 3 ：尾静脉注射无法保证特异性敲减某基因，可用基因小鼠

“ 研究方案中使用 shRNA 腺病毒 （ AAV ） 对目标基因进行敲减，靶向性和效率都存在问题，建议使用基因鼠来设计研究方案 ” 。

那么我们需要讨论两个问题：

• 腺病毒动物实验中，是否有其他方式比尾部静脉注射要更加特异性呢？缺点是什么？

  
  

• CRISPR基因动物是否可以全面代替shRNA的沉默手段呢？

  
  

（一） 用于基因治疗的 AAV 是什么？

目前大多数基因治疗应用的仍是病毒载体，这些病毒载体经过改造后不具有致病性。广泛应用的病毒载体包括腺病毒载体（ ADV ）、 慢病毒载体（ LV ） 、单纯疱疹病毒载体（ HSV ）、痘病毒载体（ PV ）及 腺相关病毒载体（ AAV ） 。

AAV 载体携带 shRNA 或者过表达基因，特异性地干预靶细胞中的 X 基因

腺相关病毒载体（ AAV ） 具有宿主范围广、安全性高、免疫原性低、表达稳定和物理性质稳定等优点，已被广泛地应用于基础研究和临床试验中 , 并已成为世界上最常用的基因治疗载体之一。

而本身 AAV 入侵动物细胞不具有特异性效果，那么其注射方式会影响其特异性吗？

来自于 www.chictr.org.cn （中国临床试验注册中心）

再来看看 美国 clinicaltrials.gov 上的数据，截止 2022 年 6 月，全球已经进行了 200 多项利用 AAV 递送蛋白质基因的研究， 70 余项临床试验仍在进行中，如表中所示，占据前三的是 血液疾病、神经系统疾病和视网膜病变 ，分别占比 17.3% ， 13% 和 11.1% 。

▲ AAV 临床试验现状（星耀研究院制图）

（二） 系统注射和局部注射，孰好孰劣？

而机体的 AAV 系统性注射 中最常见的注射方法有尾静脉注射、腹腔注射等。 局部注射主要包括视网膜下腔注射、脑立体定位注射、玻璃体腔注射、肠系膜上动脉注射、脾脏注射、灌胃、肌肉注射、皮下注射、皮内注射、鞘内注射、脊神经内注射等。

我们以心脏疾病的国自然研究方案为例， AAV 在心脏的注射方式有多种 ：心肌原点注射、冠状动脉注射、颈静脉注射和尾静脉注射均可以将药物递送到心脏，通常文献报道 较多的是心肌原点注射和尾静脉注射（观看视频 ） 。

如果是动物实验的话，推荐使用特异性更强的组织直接注射，虽然创伤更大，但特异性强。

（三） ShRNA 相比 CRISPR 、 Cre\Loxp 等沉默方式，熟好熟劣？

ShRNA 腺病毒转染，只是沉默，同时相比较 CRISPR 等技术，具有脱靶效应，而其他优缺点相比较如下：

来自于源井生物

最后，总结如下：

• 虽然尾部静脉注射对机体伤害最小，但尾部静脉注射尽量更换为组织特异性地注射（局部注射），要么就构建CRISPR基因敲除的小鼠直接代替“每批小鼠”的尾部静脉注射。

  
  

• RNAi（siRNA、shRNA）的效果不如CRISPR，CRISPR技术超越RNAi已是大势所趋，因此国自然项目中可以广泛使用CRISPR技术干预目的基因的表达。最主要的是，价格并没有那么贵了，小几万能够搞定基因鼠，但就是繁育周期较长（1.5年左右）