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今年4月，《molecular Cell》杂志上刊登了一篇基于高通量测序方法研究肌细胞分化过程中circRNA功能性文章。通过RNA-Seq筛选人和老鼠（C2C12）肌母细胞（myoblasts ）分化成肌管细胞（myotubes ）过程以及肌营养不良症（DMD）状态下差异表达的circRNA，然后利用RNA干扰（RNAi）技术找到在肌肉分化过程中起作用的circRNA。更有趣的是，作者发现其中一个circRNA序列中含有开放阅读框（ORF），从而又进一步证明其具有编码蛋白的能力。由于文章内容充实丰富，小编决定分两次给大家详细解读，本次重点阐述高通量数据分析部分。
本文所研究的样本是人和小鼠（C2C12）的肌母细胞（myoblasts ，GM）以及诱导分化后的肌管细胞（myotubes ,DM），每个样本有A,B两个重复进行RNA-Seq（在circRNA进行差异表达分析中，作者还用到了人肌营养不良（DMD）样本）。作者采用FindCirc软件流程检测circRNA，结果如下表：
表1 Number of detected linear and circular splicing events per sample, Samples are
human primary and mouse C2C12 myoblasts (GM) and myotubes (DM) in two replicates (A and B).
首先，作者对找到的circRNA进行基因组区域注释，发现90%的circRNA源自编码蛋白基因的外显子区 （图1C）。此外，研究人员发现有相当一部分的circRNA在人类和老鼠之间具有保守性，特别是对于那些高度表达的circRNA（图1D）。
图1
作者又单独分析了分化过程中mRNA的表达情况。首先，基于FPKM,作者证明两个重复之间具有高度的一致性（图2B上），特别是高表达的基因。差异基因分析发现肌细胞分化过程中有至少3000个基因上调或下调（图2B下）。对人和老鼠中差异表达的基因进行GO注释，富集在相同的生物进程中（图2C）。
图2
作者仅在人类样本中研究circRNA的差异表达，并限制至少有5个back-splicing reads的circRNA才被纳入。首先，作者绘制热图来整体了解分化以及疾病状态下样本间表达谱差异（图3B），样本间聚类分析告诉人们两层含义：第一，分化前和分化后细胞分别聚集在两大类中，说明肌细胞分化过程在circRNA表达中起到主要作用；第二，肌营养缺乏的细胞又区别于正常未患病细胞，说明疾病状态也调节circRNA表达（图3B）。
研究人员想进一步探究差异表达的circRNA与其linear gene的变化关系。他们以DM分化到GM过程中FoldChange的比例作为量度，发现circRNA与linear gene的表达改变呈现正相关关系（图3E）。此外，作者还发现在上调的基因中，circRNA的丰度显著高于无差异和下调组（图3F）。
图3
