层粘连蛋白-胶原蛋白 I 基质胶可以用大鼠尾源胶原蛋白 I 或牛源胶原蛋白 I 制备——对于这两种情况,实验者必须首先制备 4 mg/mL 的胶原蛋白 I 凝胶(详见「制备胶原蛋白 I 凝胶」一节中的相关指引)。
① 务必使用预冷到 4 ℃ 的移液器吸头对凝胶进行移液!
② 在制备层粘连蛋白-胶原蛋白 I 凝胶时,鉴于其高粘度特性,建议对包含层粘连蛋白与胶原蛋白 I 的所有操作步骤实施反向移液。
其具体操作为:先将移液器按压至预设的第二压力点,使凝胶完全填充移液器吸头;待分配凝胶时,仅达到第一压力点即行释放,此举可确保移液器吸头内残留的凝胶被排除,同时确保分配体积的精确度。另外,为优化操作,可选用专为高粘度液体设计的移液器,如 Eppendorf Visco 系列吸头或 Gilson Microman E 型移液器,以提高工作效率。
③ 请特别注意,即便在 4°C 条件下,凝胶混合物在发生初步凝胶化前的可操作时间也仅限于大约 5 min,因此需严格控制操作时间以保证实验效果。
● 在实验前一日,将层粘连蛋白 I 放在 4 °C 冰箱中的冰上,使其缓慢解冻过夜;
● 实验当日,需预先将凝胶制备所需的全部材料,以及一个无菌试管(其容量应足以容纳最终凝胶的总体积)放置于层流罩内的冷却架上。在凝胶的整个制备过程中,务必保持所有材料及凝胶处于冷却架上。
① 由于生产过程中的批次间差异,试剂瓶内胶原蛋白 I 的浓度可能会存在波动。
② 在制备 4 mg/mL 的最终工作溶液之前,需先将胶原蛋白 I 制为 4.5 mg/mL 浓度的母液。
③ 在制备过程中,建议查阅胶原蛋白 I 产品页面上的分析证书(CoA),该证书详细记录了每个批次特定的胶原蛋白浓度信息。
● 进行稀释前,将试剂瓶中的胶原蛋白 I 反复吹打混匀;
● 制备胶原蛋白 I 母液:将胶原蛋白 I 稀释至 4.5 mg/mL,大鼠尾源胶原蛋白 I 用 17.5 mM 乙酸进行稀释,牛源胶原蛋白 I 用 0.1 M 乙酸进行稀释;在进行稀释操作前,务必参考该批次产品的分析证书(CoA),以获取准确的胶原蛋白 I 浓度信息;制备 4 mg/mL 胶原蛋白 I 工作溶液:将试管放在冷却架中,按照表 1 所示顺序,逐一将除胶原蛋白 I 之外的所有组分加入已预冷的试管内,反复吹打以充分混匀管内容物;随后,向上述试管中缓缓加入适量胶原蛋白 I 母液至 4 mg/mL 工作浓度,反复吹打以充分混匀管内容物;试管须始终置于冷却架内。
表 1:用于配制 4 mg/mL 胶原蛋白 I 工作溶液的移液方案
● 将层粘连蛋白工作溶液与胶原蛋白 I 工作溶液以 1:4 体积比混合(例如,将 400 μL 层粘连蛋白工作溶液与 100 μL 胶原蛋白 I 工作溶液混合);试管始终置于冷却架内,用移液器反复吹打混匀;现在,凝胶混合溶液业已制备完毕,可将其加入 μ-Slide 3D 载玻片中。
● 在层流罩下,从无菌包装中取出 ibidi μ-Slide 3D 载玻片;
● 将一张刻度纸放入载玻片下方,以调节基质胶体积——确保刻度纸和孔之间的距离为约 1~2 cm;
● 务必使用预冷到 4 ℃ 的移液器吸头对凝胶进行移液;
● 为防止凝胶内部形成气泡,需在将凝胶溶液注入孔中之前,用 10 μL 移液器在凝胶溶液中轻柔吹打 3 次进行充分混合,同时保持吸头始终浸没在凝胶溶液中;向 μ-Slide 3D 载玻片的每个孔中加入10 μL 基质胶;加入基质胶时,应将移液器枪头直立在孔中央,以免基质胶流入外孔;用盖子盖上载玻片。
图 2:在 μ-Slide 3D 载玻片中加入基质胶。
表面平坦的无凹液面基质胶对于获得最佳的成像质量至关重要。为此,每个内孔中的基质胶体积需要精确到 10 μL。然后,由于层粘连蛋白-胶原蛋白 I 凝胶溶液粘度高的特性,实验者可能需要将移液枪的移液体积调整到大于或小于10 μL。为了控制基质胶用量,可将 ibidi μ-Slide 3D 载玻片放在刻度纸上方 1~2 cm 处,然后通过孔观察刻度纸的网格。若基质胶体积精确到 10 μL,网格不会放大或缩小;若刻度纸的网格缩小,则需要增加移液体积;反之,若网格放大,则必须减少移液体积。
图 3:使用刻度纸调整μ-Slide 3D 载玻片中的凝胶体积。
● 如下图所示,将载有基质胶的 μ-Slide 3D 载玻片与无菌湿纸巾一同放入一个10 cm 的培养皿中,并盖上皿盖,用以保持实验环境的湿度;
● 将上述培养皿置于 37°C 培养箱中孵育 60 min,以促进凝胶聚合;
● 同时制备细胞悬液(请参阅「接种细胞」一节)。
图 4:将μ-Slide 3D 载玻片放入加湿室中。