生物大分子的液相分析策略

一、蛋白质分析

• 反相高效液相色谱（RP - HPLC）

• 原理 ：基于蛋白质在疏水性固定相和极性流动相之间的分配差异。固定相通常是键合有 C18 或 C8 等烷基链的硅胶，流动相是水 - 有机溶剂（如乙腈或甲醇）的混合体系，并含有适量的酸（如三氟乙酸）或缓冲液。在酸性条件下，蛋白质的极性基团质子化，增强其疏水性，从而与固定相相互作用。随着有机相比例的增加，蛋白质依次被洗脱下来。

• 应用场景 ：常用于蛋白质的纯度鉴定、分离和定量。例如，在重组蛋白药物的生产过程中，用于检测产品的纯度，分离杂质蛋白。

• 注意事项 ：由于蛋白质在反相色谱柱上的吸附较强，可能会导致变性和失活。为减少这种情况，流动相中的有机溶剂比例变化应较为缓慢，并且需要在合适的温度下操作，避免蛋白质的不可逆变性。

• 尺寸排阻色谱（SEC）

• 原理 ：也称为凝胶过滤色谱，是根据蛋白质分子大小进行分离的方法。固定相是具有一定孔径分布的凝胶颗粒，小分子蛋白质能够进入凝胶的微孔内部，而大分子蛋白质则被排阻在微孔之外，从而使大小不同的蛋白质按顺序流出色谱柱。

• 应用场景 ：用于蛋白质的分子量测定、分离和去除聚集物。在生物制药领域，用于监测蛋白质药物在储存过程中的聚集情况，确保产品质量。

• 注意事项 ：需要选择合适孔径的凝胶柱，以确保目标蛋白质能够得到有效分离。同时，流动相的选择要考虑对蛋白质的溶解性和稳定性，一般使用缓冲溶液作为流动相，如磷酸盐缓冲液。

• 离子交换色谱（IEC）

• 原理 ：蛋白质表面带有可电离的基团，在不同的 pH 值下带有不同数量和种类的电荷。离子交换色谱的固定相带有相反电荷的离子基团，通过静电引力吸附蛋白质。然后，利用流动相中的盐离子浓度或 pH 值的变化来洗脱蛋白质。

• 应用场景 ：用于蛋白质的分离、纯化和电荷异构体的分离。在蛋白质组学研究中，用于从复杂的生物样品中分离具有不同电荷性质的蛋白质。

• 注意事项 ：要根据蛋白质的等电点（pI）选择合适的离子交换树脂和流动相 pH 值。例如，对于碱性蛋白质，可使用阳离子交换树脂，将流动相 pH 值调节到低于其 pI，使蛋白质带正电荷，便于吸附和分离。

• 亲和色谱（AC）

• 原理 ：利用蛋白质与特定配体之间的特异性亲和力进行分离。固定相上连接有能与目标蛋白质特异性结合的配体，如抗体、酶底物、金属离子等。当含有目标蛋白质的样品通过色谱柱时，蛋白质与配体结合，然后通过改变流动相条件（如加入竞争剂或改变 pH 值、离子强度）来洗脱蛋白质。

• 应用场景 ：用于高纯度蛋白质的分离和富集。在生物标志物的发现和纯化过程中，利用亲和色谱可以从复杂的生物体液（如血清、血浆）中分离出目标蛋白质。

• 注意事项 ：需要选择合适的配体，并确保配体与蛋白质之间的亲和力适中。亲和力过强可能导致洗脱困难，过弱则可能无法有效吸附蛋白质。

二、核酸分析

• 离子交换色谱 （IEC）

• 原理 ：核酸分子带有磷酸基团，在一定的 pH 值下带有负电荷。离子交换色谱的固定相带有正电荷的离子基团，通过静电引力吸附核酸。通过改变流动相中的盐离子浓度和 pH 值来洗脱核酸，不同长度和结构的核酸与固定相的亲和力不同，从而实现分离。

• 应用场景 ：用于核酸的分离、纯化和定量。在基因工程领域，用于分离不同长度的 DNA 片段，如从限制性内切酶消化产物中分离目的基因片段。

• 注意事项 ：流动相的盐浓度和 pH 值对核酸的分离效果影响较大。一般使用含有适当浓度氯化钠或其他盐类的缓冲液作为流动相，并且要注意缓冲液的 pH 值应在核酸稳定的范围内。

• 反相高效液相色谱（RP - HPLC）

• 原理 ：在核酸分析中，反相色谱主要用于寡核苷酸的分离。通过对寡核苷酸进行化学修饰，如在末端添加疏水基团，使其能够在反相色谱柱上进行分离。固定相是常见的 C18 或 C8 等烷基键合硅胶，流动相是水 - 有机溶剂（如乙腈）的混合体系，含有适量的缓冲液和离子对试剂。

• 应用场景