专家点评Science｜叶思达等构建诺氏疟必需组谱揭示抗疟药物敏感性决定因子

点评｜江陆斌 （中国科学院上海免疫与感染研究所） 、张青锋 （同济大学） 、申邦 （华中农业大学）

疟疾被世界卫生组织与艾滋病、结核病一并称为全球三大传染病。这种疾病常见于气候温暖的地区，如非洲、东南亚及南美洲等热带及亚热带地区。每年约有2.49亿病例，导致约608,000人死亡。由于对有限药物的依赖以及耐药性的出现，人类抗击疟疾的措施正受到严重威胁。

2025年2月7号，哈佛大学T.H. Chan School免疫与传染病系 Manoj Duraisingh 团队与马萨诸塞大学数学系 Kourosh Zarringhalam 团队合作在 Science 杂志以Research Article的形式发表题为 The essential genome of Plasmodium knowlesi reveals determinants of antimalarial susceptibility 的研究论文 （Brendan Elsworth/叶思达/Sheena Dass为共同第一作者） 。 (同期背靠背发表在Science上的还有来自Jenna Oberstaller等人的题为 Supersaturation mutagenesis reveals adaptive rewiring of essential genes among malaria parasites 的文章, 以及专门针对这两篇文章的评述观点文章“Not just monkey business”) 。 该研究利用转座子突变技术在诺氏疟中建立了迄今为止最高精度和最全面的疟原虫必需组谱，并且设计了新的数学模型HMS和OIS, 可以同时在全基因组水平提取转座子插入特征来表征蛋白编码基因, 转录本异构体和长链非编码RNA的必需性和可截断性。 研究人员首次发现了间日疟分支特有的必需代谢通路, 意外的是, 被广泛认为是恶性疟药物潜在靶标的香叶基二磷酸合成酶 (FPP/GGPPS) 在体外培养的诺氏疟原虫中被该团队证明是非必需的，并通过合并转座子突变体库和一线抗疟药物双氢青蒿素 (DHA) 与临床二期在研药物GNF179扰动实验，他们 发掘了全新的抗疟药物抗性/敏感基因以及协同用药机制，同时发现了一系列抗疟药物敏感性决定基因 ，更进一步，研究人员为了增加该研究数据的传播性，专门搭建了在线应用网站: https://umbibio.math.umb.edu/PkEssenDB/。简单来说， 该研究为新型疟疾疫苗和抗疟药物的开发提供了一个精确制导“地图” 。

疟疾俗称“冷热病”、“打摆子”、“发疟子”，通过雌性按蚊叮咬或输血传播，是一种由疟原虫感染引起的血液寄生虫病，中国曾是疟疾肆虐最严重的地区之一。能感染人类的疟原虫主要包括恶性疟原虫 （ Plasmodium falciparum ） 、三日疟原虫 （ Plasmodium malariae ） 、卵状疟原虫 （ Plasmodium ovale ） 、间日疟原虫 （ Plasmodium vivax ） 及诺氏疟原虫 （ Plasmodium knowlesi ） 5种。其中间日疟是感染分布最为广泛的疟原虫种，而诺氏疟在进化上与间日疟原虫同属一个分支，由于间日疟原虫目前还无法在体外培养，诺氏疟成为研究间日疟的理想体外模型。尽管疟原虫的功能基因组研究进行多年，在过去十年，顶复门寄生虫中，已经在恶性疟原虫，伯氏疟原虫 （ Plasmodium berghei ） 和弓形虫 ( Toxoplasma gondii ) 中有对应的必需组报道，但这些必需组要么存在基因覆盖度不够，要么假阳性较高的问题 （假阳性主要来源于突变饱和度不够以及基于转座子插入模式的必需性表征数学模型不够好） ，同时从未有达到可截断蛋白结构域精度和全基因组范围内非编码区必需性注释的必需组被发布，而间日疟分支的必需组谱还完全处于空白阶段，这严重限制了疫苗和治疗靶点开发的优先级排序。

诺氏疟原虫基因组的高密度转座子诱变

为了生成诺氏疟原虫的饱和转座子突变文库 （血液增殖阶段） ，研究者们在能支持更高转染效率的猕猴红细胞中使用了一种高活性的piggyBac转座酶，这种转座酶会随机识别基因组中的TTAA motif来进行转座子序列插入，从而阻止转录。该团队进行了43次转染并把3-4次转染的被感染红细胞汇集成10个独立的转染池。通过使用一组“背景校正基因” （这些基因的直系同源基因在多种顶复门寄生虫中是必需的） ，从所有潜在位点中去除因死亡寄生虫和持续的低水平转座活性带来的背景信号。

来源于一个转染池的同一TTAA位点的所有插入可以被称为一个独立插入事件。在背景校正后，他们在筛选中观察到 1,456,750 个独立插入事件，覆盖了全基因组80.1%  的所有TTAA 位点和99.3%的至少包含一个 TTAA 位点的蛋白编码基因。这一插入数量约是此前在恶性疟原虫 piggyBac 筛选中实现的插入数量的 38 倍。通过 qPCR 测定，每个寄生虫基因组的平均转座子插入数量约为 1.76个。为了定量评估突变体库是否达到基因水平饱和所需的插入数量，他们通过数学模型模拟插入，结果表明实现的插入数量比基因水平饱和所需数量高出 3.6 到4.7 倍。

开发新数学模型HMS，OIS和FIS鉴定基因必需性，适应性和可截断性

从前的转座子突变基因必需性预测数学模型会有假阳性较高的问题，例如对转录本长度会有一定的偏向性，也就是越长的，包含更多TTAA 的基因转录本会被更容易预测为非必需基因，而越短的，包含更少TTAA的基因转录本会被更容易预测为必需基因，同时也没有考虑转座子插入在转录本上空间分布因素的影响。研究者们通过整合转座子插入在转录本中的空间分布信息，每个基因编码区的TTAA总数量以及转座子插入数量，临近位点插入情况等多个因素，开发了基于贝叶斯网络模型和混合高斯分布模型的新的基因必需性预测数学模型HMS。同时，他们利用10个转染池中的独立插入事件开发了第二个更为保守，统计功效更好的OIS模型。

通过全面的benchmark分析比较，HMS相比较以前的数学模型MIS预测假阳性显著降低，而OIS对必需基因的预测准确度最高，牺牲的是对非必需基因的预测准确度。

总体而言， 诺氏疟基因组2037 个（38.68%）基因被归类为必需基因，2124 个（40.34%）基因被归类为“非必需”，1105 个（20.98%）基因为不确定基因。 这些不确定基因又可以被研究者们开发的适应度指数模型FIS和可截断性分析模型进一步解释。更进一步，研究者们鉴定了 126 个突变会导致疟原虫适应性降低的基因、122 个可以在 5'端 或 3' 端截断的基因以及 53 个必需的长链非编码RNA （lncRNA） ，以及所有可鉴定的转录本异构体的必需性。

间日疟分支的特定必需通路发现和扰动分析揭示抗疟药敏感性的决定因子

通过比较必需组分析，他们意外发现了之前已经广泛接受的恶性疟原虫药物潜在靶点香叶基二磷酸合酶 （FPP/GGPPS） 在体外猕猴红细胞培养的诺氏疟原虫中是非必需的，这一结论被研究者发现PfFPP/GGPPS抑制剂MMV019313 在诺氏疟中IC50比恶性疟高出9.5倍所支持。更有趣的是，该团队揭示了包括鸟氨酸氨基转移酶 (OAT) 和谷氨酸脱氢3 (GDH3) 等多个三羧酸 （TCA） 循环通路基因在诺氏疟中是必需的, 而在恶性虐和伯氏疟中是非必需的，并且与恶性疟原虫相比，诺氏疟原虫和间日疟原虫均受到三羧酸循环关键催化酶乌头酸酶 （Aconitase） 抑制剂——氟乙酸钠的抑制。这些证据都指向了诺氏疟原虫表现出对三羧酸 （TCA） 循环基因通路的更大依赖性。同时，他们还 报道了17个在诺氏疟中必需的抗原基因，可以作为未来潜在的疫苗开发靶点，而其他已经在恶性疟和伯氏疟中被报道和验证的疫苗抗原基因例如MSP1, AMA1, SRA等的必需性和该研究的必需组数据是一致的。

近年，抗疟一线药物双青蒿素DHA的抗药案例被多次报道，其药物准确靶点也还未被完全发现，该药物的协同用药机制和抗药机制信息也有待发掘。而另外一种临床二期在研药物GNF179的靶点和抗药机制也还未完全研究清楚。研究者们利用构建的饱和转座子突变体库进行了以上两种药物的扰动实验，而后的差异插入分析应证了一系列已经被报道验证的药物抗性基因例如GNF179的抗性基因acetyl-CoA transporter，也发现了一些新的DHA和GNF179敏感和抗性基因。研究者们挑选了DHA扰动实验中转座子插入富集的Riboflavin kinase （RFK） 基因进行了进一步验证，通过RFK的抑制剂roseoflavin和DHA的FIC50实验显示roseoflavin对DHA的药物活性有拮抗作用，他们进一步证实了药物扰动实验中RFK突变体在DHA药物下适应性增强的结论。

综上， 该研究首次提供了间日疟分支的高精度疟原虫必需组谱，开发了新的转座子突变必需性预测数学模型HMS和OIS，发现了间日疟分支特有的必需代谢通路和抗药敏感性的决定因子，为优化疟疾疫苗，新药开发和疟疾功能基因组研究提供了重要参考信息。

FDA 研究员/前哈佛大学博士后Brendan Elsworth，哈佛大学免疫与传染病系Manoj组和马萨诸塞大学数学系Kourosh组联合培养博士叶思达，哈佛大学博士后Sheena Dass为该研究的共同第一作者。哈佛大学Manoj Duraisingh教授和马萨诸塞大学Kourosh Zarringhalam教授为该研究共同通讯作者。波士顿学院Marc-Jan Gubbels教授对课题和论文撰写，修改提供了重要帮助。

专家点评

江陆斌 （中国科学院上海免疫与感染研究所研究员）

疟疾是经按蚊叮咬或输入带疟原虫者的血液而感染疟原虫所引起的虫媒传染病，是已知最古老的人类疾病之一。至今仍然造成每年近2.5亿感染和60万死亡病例，是世界三大传染病之一。疟疾也曾经是我国历史上最严重的传染病之一，建国初期，我国每年报告约3000万例疟疾病例。经过几代疾控工作者和科研人员70多年的不懈努力，我国于2020年正式宣布消除疟疾，并于2021年6月30日获得世界卫生组织 （WHO） 的无疟疾认证。但输入性疟疾在华中、华南和西南省份呈上升趋势。在世界范围内，包括青蒿素在内的各类抗疟药都已经在恶性疟原虫体内产生了临床耐药性，尤其是至今仍然缺乏有效的疟疾疫苗，全球消除疟疾计划面临的挑战依然严峻。因此,研制新型抗疟药与疟疾疫苗刻不容缓,并具有重大的社会和经济意义。显然，疟疾预防与治疗新措施的研发成功将得益于对疟原虫关键性致病基因功能的全面理解。目前，人们对疟疾防治的关键靶标所知甚少。这主要是由于疟原虫具有庞大的真核生物基因组 （其基因组比大多数病毒和细菌中的基因组大500~1000倍） 、复杂的多宿主生活史、以及缺乏有效的基因编辑技术。因此，疟原虫功能基因组学一直是领域内的研究热点。

2025年2月7号，哈佛大学T.H. Chan School免疫与传染病系 Manoj Duraisingh 团队与马萨诸塞大学数学系 Kourosh Zarringhalam 团队合作在 Science 杂志以Research Article的形式发表题为 The essential genome of Plasmodium knowlesi reveals determinants of antimalarial susceptibility 的研究论文。该研究利用piggyBac转座子突变技术在诺氏疟原虫的猕猴红细胞培养体系中建立了高精度的疟原虫必需组谱，并且设计了新的数学模型HMS和OIS，在全基因组水平系统分析了转录本异构体和长链非编码RNA的必需性和可截断性。在可以感染人类的5种疟原虫中，恶性疟原虫危害最大，间日疟原虫分布最广。早期通过类似技术体系，研究人员已经在恶性疟原虫中建立了必需基因组谱。但由于缺乏针对约氏疟原虫的体外培养系统，本文作者采用在进化上与间日疟原虫同属一个分支的诺氏疟原虫开展了基于转座子突变的功能基因组学研究，建立了覆盖了全基因组80.1%的所有TTAA可插入位点以及99.3%的蛋白编码基因的突变体库。该突变数量约是此前在恶性疟原虫piggyBac筛选中获得的转座子插入数量的38倍，比预测的基因水平饱和所需插入数量高出3.6到4.7倍。在此基础上，作者利用新开发的假阳性率更低、准确度更高的多种数学模型，预测了诺氏疟原虫基因组2037个（38.68%）基因为必需基因，2124个（40.34%）基因为非必需基因，其余为不确定基因。同时还鉴定了126个突变会导致疟原虫适应性降低的基因、122个可以在5'端或3'端截断的基因以及53个必需的长链非编码RNA （lncRNA） ，以及所有可鉴定的转录本异构体的必需性。为证明该疟原虫饱和转座子突变体库在抗疟药研究中的应用潜力，作者采用一线抗疟药双氢青蒿素DHA和一种临床在研药物GNF179在突变库中开展了药物扰动实验。实验结果不仅证实了已被报道的抗性基因，也发现了一系列新的针对DHA和GNF179的潜在敏感和抗性基因。该研究成果为研究人员在全基因组范围内优化抗疟药和疟疾疫苗靶标分子提供了重要的实验材料和理论基础。

在Science杂志同期发表的另一篇文章中，研究人员在人红细胞培养体系中也建立了针对诺氏疟原虫的转座子突变体库。有意思的是，两个已知的恶性疟原虫药物靶标 （香叶基二磷酸合成酶FPP/GGPPS和二氢蝶酸合酶DHPS） 在这两篇背靠背发表的论文分别被预测为必需基因和非必需基因。这一结论差异可能是由于两种不同的宿主红细胞与诺氏疟原虫代谢互作过程的差异造成的，也可能从全新的角度揭示了疟原虫代谢通路在进化过程中针对不同宿主的基因功能差异。因此，利用该突变体库，后续针对疟原虫生活史不同时期开展代谢组学研究，将为理解疟疾发病的本质提供重要的参考信息。

专家点评

张青锋 （同济大学 教授）

人类疟疾由多种疟原虫属的寄生虫引起，通过蚊子传播。恶性疟原虫 （Plasmodium falciparum） 是导致大多数疟疾死亡和感染的主要病原体，而间日疟原虫 （Plasmodium vivax） 的 特点是分布广泛并与复发性疾病相关。猴疟原虫 （Plasmodium knowlesi） 例如自然感染猕猴，但在东南亚地区已成为人类感染的重要原因。由于猕猴作为疟原虫的储存宿主，现有的疟疾控制方法 （如治疗感染和灭蚊） 在应对这种人畜共患的疟疾方面效果有限。在现有人类疟原虫中，只有恶性疟原虫的血液阶段能够在体外培养，这对于药物筛选、疫苗测试和基因功能研究至关重要。由于恶性疟原虫在进化上与其他人类感染疟原虫存在显著差异，研究间日疟原虫的工具非常有限。猴疟原虫在系统发育上与间日疟原虫关系密切，填补了这一研究空白。猴疟原虫不仅历史悠久，且作为实验室模型已推动了如抗原变异等经典疟疾生物学的发现。Elsworth/叶思达/Sheena等人和同期 Science 另一篇背靠背文章Oberstaller等人都选择使用的转座子诱变方法 （一个是在猕猴红细胞体外培养，一个是在人红细胞体外培养） 则不受同源重组低效率或基因特异性靶向载体可用性的限制。piggyBac转座子系统通过外源酶的表达，促进转座子在基因组特定位点 （TTAA） 插入，从而确定基因的必需性。这一方法利用了疟原虫基因组中丰富的AT序列，显著提高了猴疟原虫的转染效率和基因插入覆盖率。

该团队把疟原虫中的突变饱和程度提升了一个数量级，从而导致能有机会首次更全面地定义包括非编码区和基因可截断性的必需基因组。并且开发了新的统计效用更为准确的HMS和OIS模型，从而避免了2018年发表的恶性疟原虫必需组谱中定义基因必需性的MIS模型对基因CDS长度有偏好性从而导致必需性预测准确度相对较低的缺陷。

通过比较基因组分析，该团队揭示了鸟氨酸氨基转移酶 (OAT) 和谷氨酸脱氢酶3 (GDH3) 在猴疟原虫中是必需的，但在恶性疟原虫中则不是，这表明猴疟原虫和间日疟原虫在血液阶段更依赖三羧酸循环。而同期Oberstaller等人发现，核苷转运蛋白1在恶性疟原虫中必需，但在猴疟原虫中则可有可无，这可能与不同宿主红细胞中的嘌呤水平差异有关。这两篇文章相互应证了猴疟原虫有高水平的代谢可塑性，这可能使其能够适应新的宿主。

更进一步，Elsworth/叶思达/Sheena等人利用构建的突变体库进行了药物扰动实验，发现了一系列药物敏感性决定因子，更重要的是，这证明了转座子突变体库可以应用到其他广泛的扰动分析的潜力，能够大幅提升疟原虫功能基因组研究的效率。

这项研究不仅为疟原虫的进化和生物学提供了新的见解，还为开发广谱抗疟药物和疫苗提供了潜在靶点。未来的研究可以进一步探索其他发育阶段包括肝脏阶段的基因必需性变化，以及不同实验/逆境条件下基因必需性的动态变化，帮助深入理解寄生虫如何适应环境并应对治疗。

专家点评

申邦 （华中农业大学 教授）

过去几十年来，人们在疟原虫的功能基因组学方面做了大量的研究，代表性的工作包括在全基因组或亚基因组水平对恶性疟原虫和伯氏疟原虫进行遗传筛选，鉴定每个基因在红内期对疟原虫生长的重要性 （Cell, 2017; Science, 2018） ，这些工作发现了一大批对疟原虫生长繁殖有关键作用的基因，为药物和疫苗开发提供了重要信息。但这几项研究都存在基因组覆盖度不够的问题。2025年2月在 Science 上发表的 The essential genome of Plasmodium knowlesi reveals determinants of antimalarial susceptibility 研究论文，采用PiggyBac转座子技术在诺氏疟原虫建立了几乎饱和的插入突变文库，除了138个不含TTAA位点 （PiggyBac转座子的插入位点） 的基因外，该突变体库包含1,456,750个转座子插入事件，涵盖基因组上80.1%的TTAA位点和99.3%的含有至少一个TTAA位点的蛋白编码基因，这种前所未有的覆盖度为后续基因功能的预测分析奠定了非常好的基础。作者团队开发了混合评分模型 （Hybrid Model Score, HMS）（对包含5个及以上TTAA位点的基因采用Bayesian mutagenesis score，对只含有5个以下TTAA位点的短基因采用modified mutagenesis index score） ，结合转座子在每个基因中的插入情况将基因分为必需基因 （2037个，占比38.68%) 、非必要基因 （2124个，占比40.34%)） 和介于二者中间的基因 (1105 个，占比20.98%) 。同时，通过对数据的深入挖掘，发现了一些必需的长链非编码RNA基因；采用更多的数学模型 （如binarized mutability of sites模型等） 分析数据，发现了一些基因可被转座子插入突变，但插入仅限于基因的5‘或3’端比较短的区域内，导致截断的蛋白产物，这些基因基本都是虫体的必需基因，只是5‘或3’端小范围内的插入对蛋白的功能影响不大。这样的分析工作和对该类基因的预测工作只有在转座子插入事件够多，覆盖度够高的情况下才有可能。

在完成了诺氏疟原虫基因重要性的鉴定后，作者团队把这些结果与恶性疟原虫和伯氏疟原虫中遗传筛选的结果进行了比较，发现了一些很有意思的现象，尽管这些虫体共享了一大批核心必需基因，它们之间的基因必要性存在显著差异，比如，三羧酸循环中的多个酶在诺氏疟原虫中是必需的，但在恶性疟原虫和伯氏疟原虫中它们对红内期的虫体不重要；另一方面，当前认为的热门药物靶点FPP/GGPPS (farnesyl / geranylgeranyl diphosphate synthase) 在恶性疟原虫中是必需的，但是对诺氏疟原虫却不那么重要，这些物种间的差异为抗疟药物设计提供了非常关键的、之前没有认识到的信息。此外，将双氢青蒿素等药物作用于突变体库筛选对药物更敏感或者有抗性的突变体，不仅可以发现药物的作用或抗性机制，还能为联合用药提供参考，比如研究中发现两个线粒体代谢酶NDH2和RFK的突变能导致青蒿素耐受，而RFK的抑制剂虽然也有抑制虫体生长的作用，但是它会拮抗青蒿素的杀虫作用。

这项研究通过高覆盖度的转座子插入突变绘制了诺氏疟原虫在猴红细胞内生长时的高分辨率基因必要性图谱，揭示了代谢通路等潜在药物靶标的物种间差异，其成果不仅深化了对疟原虫适应性进化的理解，更为疟原虫的药物开发和耐药监测提供了关键靶标。与上述论文背靠背同期发表在 Science 上的还有来自 Jenna Oberstaller 等人的题 Supersaturation mutagenesis reveals adaptive rewiring of essential genes among malaria parasites 的文章，这两篇论文的工作非常类似，得到的结果也非常接近。但是Oberstaller等人的筛选工作是用不同的诺氏疟原虫虫株，在人的红细胞里面做的，因此其结果与上述用猴红细胞内筛选得到的结果有细微的差别，这些差别既说明了虫体适应环境的可塑性，也是设计疫苗和药物时需要重点关注的。

原文链接：

https://www.science.org/doi/10.1126/science.adq6241

制版人：十一

BioART战略合作伙伴

（*排名不分先后）

BioART友情合作伙伴

（*排名不分先后）