PNAS解译|用APT和ToF-SIMS探究有孔虫的生物矿化

研究背景

碳酸钙生物矿物骨架的形成对于不同海洋生物群体的生存至关重要，并且是全球碳循环的主要组成部分。更重要的是，这些骨骼记录了形成时海洋环境的地球化学信息，为研究古气候提供了宝贵的资料。然而，尽管生物矿化在进化、全球化学循环和古气候研究中具有重要意义，但人们对生物矿化的具体过程仍然理解不透彻，尤其是在环境变化下生物矿化的响应机制以及壳体地球化学的影响方面。

生物矿化的过程比较复杂，涉及生物体对离子的调控、水溶液的化学物种操纵以及有机-无机相互作用，这些过程共同决定了骨骼矿物的形态、组成和生长速率。许多生物矿化过程从有机框架（Organic templating structures）开始，有机框架能够为无机矿物的沉积提供一个“模板”，引导矿物的生长方向、形态和晶体结构。因此，理解有机框架在生物矿化中的作用对于完善生物矿化的理论框架至关重要。作者探讨了有机框架在碳酸钙生物矿化中的作用，特别是其如何影响壳体的化学组成和成核过程。

图1  Orbulina universa的球壳是围绕 POS 生长的，具有化学异质性。A是Orbulina universa的光学显微照片，具有钙化的球形腔，周围环绕着方解石“刺”和细胞，与甲藻共生；B是方解石球的SEM照片，白色箭头标识的是嵌入式POS，方解石在POS两侧沉淀；C是琼脂固定的脱钙壳壁（较浅，右侧）和孔（较暗，左侧）横截面的TEM照片；D_1-3是通过ToF-SIMS得出的4天的壳壁的⁴³Ca/⁴⁰Ca、²⁴Mg/⁴⁰Ca和²³Na/⁴⁰Ca在横截面上的变化图。白色箭头指示POS的位置，与POS相关的区域的Na和Mg含量升高；E是另一个样本壳壁内富含钠的方解石柱的底部，进一步确定了D₃中与POS相关的富钠带；F₁中是D中的白框区域放大；F₂放大突出显示了POS中唯一存在的重合Mg/Ca和Na/Ca最大值。

研究目的

作者希望通过高分辨率的APT和ToF-SIMS手段对有孔虫Orbulina universa开展原子尺度上的研究，为理解海洋生物矿化的机制提供新的视角，并为基于壳体地球化学的古气候重建提供更准确的解释。

有孔虫Orbulina universa已被广泛用作研究有孔虫生物矿化和地球化学的模式生物。碳酸钙的壳体包含一个单一的嵌入式有机结构，称为初级有机片层(Primary Organic Sheet简称POS)（图 1 B 和 C），它是在骨骼形成的初始阶段产生的，并且是由多糖和酸性氨基酸组成，多糖成分使有机框架具有结构完整性，酸性氨基酸引导方解石成核。POS 周围的液体被认为源自海水，并在钙化之前通过未知机制发生改变。在Orbulina universa中，成核和矿物生长发生在 POS 的两侧，将有机框架包裹在生物矿物内。这种嵌入式 POS 位于测试区域内（外壳，图 1），并为其有机框架化学的多尺度研究提供了理想的目标。生物矿化过程中，有机框架与无机矿物之间的相互作用能够调控碳酸钙的成核和生长。有机模板的表面化学性质（如电荷和极性）可以吸引特定的离子（如Ca²⁺、Mg²⁺和Na⁺），从而促进碳酸钙在模板表面的异质成核。

有机框架还可能影响碳酸钙的晶体形态、多形体选择以及壳体中的微量元素含量。在Orbulina universa中，初级有机片层（POS）是碳酸钙壳体形成过程中起关键作用的有机框架。作者认为通过APT和ToF-SIMS技术观察有机模板的纳米级化学组成，可以揭示其在碳酸钙成核和壳体组成中的作用机制。

研究方法与主要结果

作者选择了有孔虫Orbulina universa作为研究对象，先从海洋中手工采集了样品，并在实验室中按照标准方法进行培养，培养条件为21°C，12小时光照/12小时黑暗的周期，使用已知成分的海水进行培养。为了研究有机框架的化学组成，作者团队先对样品进行了化学清洗，去除了表面的有机物质，随后将样品嵌入环氧树脂中并抛光，以暴露壳体的横截面，最后进行喷金处理以便于开展仪器分析。

作者团队使用ToF-SIMS对有孔虫的壳体进行了二维化学成像分析，发现壳体内部的Na和Mg的分布与POS的存在密切相关从而表明POS在壳体的化学组成中起着重要的调控作用。

在所有分析的样品中，Orbulina universa的壳体在Mg/Ca和Na/Ca比值上表现出显著的化学异质性。这种异质性主要体现在壳体内部存在一个与初级有机片层（POS）的位置密切相关的富集Na和Mg的带状区域，其Na和Mg的浓度分别比周围矿物高出49%±20%和147%±85%。这一区域的半峰值全宽最大值（full-width-athalf-peak-maxima，简称FWHM）为673±272nm(n=18)。作者团队通过使用⁴³Ca脉冲标记法培养有孔虫，发现在壳体中的方解石产生⁴³Ca的对称富集带，这些带状结构围绕POS对称分布。ToF-SIMS分析还显示，壳体的“棘”（spine）结构起源于POS，并且这些棘结构也显著富集Na，这也进一步证实了POS与富含Na和Mg的区域之间的关联。

图2  有孔虫方解石内平面有机矿物模板表面的三维 APT 重建图像。A展示了APT 重建方解石（富钙）和有机区域（贫钙）之间的界面。B凸显出Na 在二者界面处升高。（Na 的信号已放大 2 倍）

作者团队使用三维原子探针（APT）从原子尺度绘制了单个有孔虫样本内嵌入有机结构与相邻方解石之间界面的三维化学图谱，并提供了碳酸盐生物矿物中有机框架表面的化学组成图。作者从抛光的有孔虫壳体中提取了样品，并通过聚焦离子束技术（FIB）将其制备成尖锐的探针。APT分析显示，方解石的特征是其Ca含量相对于有机层较高，而有机层的C和H含量丰富（图2、3）。有机层与碳酸钙层之间存在一个约2纳米的界面，该界面由Ca、C和H的突变定义。在有机层中，Na和Mg的浓度显著高于碳酸钙层，且Na的最大值出现在有机层表面附近。这一结果表明，有机模板表面富集了Na和Mg，这可能对碳酸钙的成核过程产生重要影响。

图3  基于APT重建得到的界面附近各元素含量变化曲线。A通过量化了界面上主要元素Ca、C、O、H的急剧变化来确定方解石和有机层之间的过渡。B凸显出Na和Mg的富集发生在界面有机一侧的前面几纳米内

通过APT观察到的有机材料中Na和Mg含量均升高，而ToF-SIMS数据中Na和Mg含量持续升高的区域仅出现在POS所在区域。这表明APT观察到的有机层可能是POS，但由于两种技术分析规模的差异，无法进行直接定量比较。

作者构建了一个定量模型来验证APT捕获的有机层在成分上是否与ToF-SIMS观察到的POS相关化学信号一致。该模型基于APT测量的有机层和方解石基质中Ca、Na和Mg的体积归一化计数，以及ToF-SIMS的光束尺寸和模拟POS的宽度。模型通过调整POS宽度来匹配ToF-SIMS中观察到的Na和Mg富集的绝对量级，同时保持其相对幅度不变。结果表明，模型能够准确预测ToF-SIMS观察到Na和Mg富集，证明ToF-SIMS中观察到的POS相关信号与APT测量的有机材料成分一致（图4）。

进一步分析表明ToF-SIMS数据中Na和Mg的最大值振幅与约130nm厚的POS一致，而POS相关信号的宽度则与700nm的POS厚度更接近。这可能是因为POS并非单一层状结构，而是集中在钙化起点周围的分散有机框架，这种复杂的几何形状导致了信号宽度的差异。通过对有孔虫样品进行透射电子显微镜（TEM）和扫描电子显微镜（SEM）的辅助分析，作者团队发现POS是分支且多面的，这与模型结果一致。此外，在从POS中提取的APT样本中也观察到了两个较小的有机结构，进一步支持了POS的复杂几何形状假设。

图4  ToF-SIMS与APT虽因空间尺度差异无法直接对比，但二者均能成像同一结构。作者通过定量模型将ToF-SIMS测得的POS区域Na、Mg富集程度与APT测得的POS成分进行比较。模型基于APT成分数据、312 nm束宽和130 nm POS厚度，解释了POS相关Mg极大值的形成机制。

重要观点

有机碳成分（特别是POS）在有孔虫壳体的化学组成中起着重要作用。POS区域富集了Na和Mg，表明有机框架对壳体的化学异质性有显著贡献。作者还发现有机框架的存在可能影响基于壳体地球化学的古气候重建。在古气候重建中，Mg/Ca常被用作古海洋温度的代用指标，Na/Ca则被认为是海洋盐度的潜在指标。通过模型计算发现，POS对Mg/Ca和Na/Ca的贡献随着壳体厚度的增加而对数下降。在薄壳有孔虫中，POS的存在可能导致基于Mg/Ca的温度估算偏高超过0.5°C，基于Na/Ca的盐度估算偏高超过1个实用盐度单位。因此，在利用培养的有孔虫进行古气候代用指标校准时，需要特别考虑POS的影响。

作者的研究还揭示了有机模板在碳酸钙成核过程中的潜在作用。有机框架表面的Na和Mg富集现象表明，非Ca²⁺离子可能在成核过程中发挥重要作用。这些离子可能通过与模板表面的相互作用，改变成核的能量障碍，从而影响碳酸钙的成核动力学，有机框架的化学组成也可能影响碳酸钙的晶体形态和多形体选择。例如，有机模板表面的电荷和极性可能吸引特定的离子，促进碳酸钙在模板表面的异质成核。作者的研究结果强调了需要进一步探索非Ca²⁺离子在碳酸钙成核过程中的作用机制。

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