| 1. ST通过与scRNA - seq技术相结合识别BPH组织中不同细胞类型的空间特征 该研究利用12个样本的scRNA-seq数据来明确前列腺组织中的不同细胞类型 (Additional fle 1: Table S3)。基于基因表达，共识别出了16个细胞群。根据已确定的标记基因，共84,835个细胞被注释为上皮细胞、间质细胞（内皮细胞、纤维细胞和平滑肌细胞）以及免疫细胞（T细胞、髓系细胞、浆细胞、肥大细胞和B细胞）。PTPRC−和EPCAM+簇被鉴定为高表达KRT8和KRT18的上皮细胞。PTPRC+簇被鉴定为免疫细胞。其中，CD3D、IL7R、CD8A、CD8B高表达的细胞簇被注释为T细胞；APOE、LYZ、IL1B高表达的细胞簇被注释为髓系细胞；MZB1高表达的聚类代表浆细胞。其余两个PTPRC+簇被注释为表达CPA3、KIT和TPSAB1的肥大细胞，以及表达MS4A1、CD22和CD79A的B细胞群。PTPRC−和EPCAM−簇被鉴定为基质细胞，由表达CLDN5、SELE和PECAM1的内皮细胞（Endo），表达C1S、DCN和C7的纤维细胞（Fib）和表达ACTA2、MYH11、RGS5的平滑肌细胞（SMC）组成 (Additional fle 1: Fig. S1D, E)。每组注释细胞类型的UMAP如图所示（Additional fle 1: Fig. S1F）。对每种细胞类型的前三个代表性基因进行鉴定验证了这些细胞的准确注释 （Additional fle 1: Fig. S1G）。 图1A+B：通过对由2945个spots组成的BPH样本进行空间转录组（Spatial transcriptomic，ST）分析，评估不同细胞类型的空间分布。BPH样本的ST部分采用苏木精-伊红（H&E）染色进行了组织学染色分析（Fig. 1A）。基于ST测序数据，空间斑点(the spatial spots)可分为7个不同的簇(C0-C6)(Fig. 1A, B)。图1C+D+E：采用稳健细胞类型分解(Robust Cell Type Decomposition，RCTD)方法将ST和scRNA-seq分析的结果进行整合，从而识别出每个空间亚群中的主要细胞类型（Fig. 1C–E）。以纤原纤维细胞为主的C0为纤原纤维（Fib）簇，分布于结节区内外。C6被确定为免疫细胞群，因为其B细胞和髓系细胞比例较高，并主要分布在结节区域外。图1F：值得注意的是，发现了4个以上皮细胞为主要成分的上皮簇（C1、C2、C3和C5），主要定位于腺上皮区域。C1斑点主要分布在结节区域内，而C2、C3和C5斑点则主要分布在结节区域外(Fig. 1F)。表明这些上皮细胞在结节形成过程中具有不同的功能作用。 Fig.S1. 前列腺组织单细胞和空间转录组图谱(n=13)
Figure1 前列腺组织中不同细胞类型的空间特征 Supplementary Table S3: ST和单细胞RNA测序所用样本的基本信息 2. ST结合scRNA - seq技术能够识别BPH组织中不同上皮亚型的空间特征为了阐明上皮细胞在结节形成中的作用，作者首先使用scRNA-seq数据进行了基于图（graph-based）的亚聚类分析，以识别不同的上皮细胞亚群。通过使用一项从先前研究中正常前列腺组织单细胞转录组谱开发的特征基因集分析差异表达基因（DEGs）和特征评分，来鉴定细胞类型(Additional fle 1: Fig. S2A, B)。图2A：鉴定到8个BE细胞亚群、2个LE细胞亚群、1个Club细胞亚群和1个Hillock细胞亚群（Figure 2A）。BE特征评分和KRT5、KRT14和KRT15表达显著上调的细胞群被归类为BE细胞。同样，LE特征评分显著升高伴随KLK2、KLK3和ACPP表达显著升高的细胞群被标记为LE细胞。此外，LE和BE评分相对较低但Club细胞标记基因(SCGB3A1、PIGR、MMP7、CP和LCN2)和Hillock细胞标记基因(KRT13、SERPINB1和CLDN4)表达水平较高的细胞群被定义为Club和Hillock细胞。图2B+C+D：随后采用RCTD方法在ST切片内精确定位这些亚群(Additional fle 1: Fig. S2C)。与结节外区相比，结节内BE细胞比例较高，LE细胞比例较低(Fig. 2B)。与结节区域外相比，结节区域内的LE权重与BE权重的比值显著降低(Fig. 2C)。这些结果表明，在结节形成过程中，BE细胞数量增加，LE细胞数量减少。LE细胞亚群方面，LE1细胞亚群主要分布于BPH组织C5上皮区域内，主要位于结节区。相比之下，BPH组织内C1和C2空间上皮区的LE2细胞亚群主要分布在结节区外(Fig. 2D; Additional fle 1: Fig. S2D,E)。图2E：为了研究这两个LE细胞亚群的功能作用，该研究使用了Hallmark基因集（N=50）对LE1与LE2细胞亚群进行了ssGSEA分析。该研究特别关注了与BPH密切相关的几个Hallmark通路，包括雄激素响应通路、上皮间质转化（EMT）通路以及与细胞增殖相关的通路（包括DNA修复通路、E2F靶点通路、G2M检查点通路和有丝分裂纺锤体通路）。该研究观察到LE1细胞亚群中存在显著上调的EMT（上皮间质转化）现象，而Androgen Response信号通路则出现下调；而在LE2细胞亚群中，则观察到了相反的模式（Fig. 2E）。图2F：在BE细胞亚群中，即BE1、BE4、BE6、BE7和BE8，它们在BPH组织中的分布主要集中在结节区域。值得注意的是，与其他BE细胞亚组相比，在大多数这些亚组（BE1、BE4和BE6）中均观察到EMT信号通路的显著上调（Fig. 2F）。BE6细胞亚群所表现出的细胞增殖增强尤其值得注意，因为这表明它们在结节形成过程中可能起到最终供体细胞（end contributor cells）的作用。相反，BE3 和 BE5 细胞亚群主要分布在结节区域外。值得注意的是，与其他BE细胞亚组相比，这两个亚组的EMT信号均显著下调(Fig. 2F)，因此与在LE细胞结节形成过程中观察到的EMT信号的改变相一致。然而，这两个亚组之间的增殖能力有显著差异。在前列腺组织中，C2和C3空间上皮区域的BE3细胞表现出增强的增殖能力，而C3和C5空间上皮区域的BE5细胞则未显示出类似效应(Additional fle 1: Fig. S2D,E; Fig. 2D, F)。有趣的是，作者观察到缺氧信号的显著增强，特别是在BE5细胞群中。缺氧诱导的EMT已被广泛报道用于各种恶性肿瘤，包括胶质瘤、前列腺癌、卵巢癌、肺癌和肝细胞癌。此外，作者已发表的先前研究已证明了EMT的关键参与和缺氧诱导良性前列腺增生（BPH）上皮间充质转化（EMT）的能力。本研究还观察到缺氧与上皮细胞EMT之间存在显著的正相关(附加文件1:图S2F)。上皮间充质转化（EMT）的过程与上皮细胞功能(如E-cadherin表达)的丧失和间充质细胞功能(如vimentin表达)的增加有关。免疫组织化学染色结果显示，BPH组织中Vimentin（r=0.68，p=0.03）表达上调和E-cadherin（r=-0.84，p=0.02）表达显著下调，同时伴有HIF-1a（缺氧标志物蛋白）的上调(Additional fle 1: Fig. S2G)。因此，本研究提出缺氧是诱导上皮间充质转化（EMT）的触发因素，其中BE5细胞亚群表现出缺氧信号通路上调，是参与结节形成的最初BE细胞群。
图2G：为了进一步阐明前列腺上皮线谱系的进化动力学动态，作者对12个不同的上皮细胞亚群进行了伪时间细胞轨迹分析。基于结节内外细胞群的分布，将LE2细胞亚群确定为这一进化轨迹曲线的独特初始点。然后生成了从结节外上皮细胞到结节内上皮细胞以及从LE细胞到BE细胞的发育轨迹(Fig. 2G)。 图2H：该研究的主要目的是研究从主要位于结节区域外的LE2亚群到主要位于结节区域内的结节形成末端效应器（nodular formation end effector）BE6亚群（Fig. 2G; Additional fle 1: Fig. S2H）的发育路径，发现缺氧、EMT和细胞增殖信号通路增强(Fig. 2H)。作者观察到缺氧信号上调的BE5细胞【其特征是高水平表达FOS和JUN(Additional fle 1:Fig. S2I)】不仅在结节形成过程中发挥启动BE细胞的作用，而且在LE向BE细胞转化过程中起过渡中间体的作用。FOS和JUN基因编码FOS和JUN蛋白家族，形成异二聚体复合体，称为激活蛋白-1 (AP-1)，发挥转录因子的作用。从Transcrip-tional Regulatory Relationships Unraveled by Sentence-based Text mining v2 (TRRUST v2) database中获得的fos-靶因子基因集和jun-靶因子基因集（FOS-target factor gene set and JUN-target factor gene set）进行基因集富集分析(GSEA)。结果表明，与其他BE细胞相比，BE5细胞中目标因子基因集的表达显著上调（Additional fle 1: Fig. S2J, K），这说明BE5细胞具有更强的AP-1转录活性。
 Figure2 上皮细胞的亚群分析
 Supplementary Figure S2.上皮细胞的亚群分析3.拟时序细胞轨迹描述了从LE到BE细胞的转变，以及从结节外BE细胞到结节内BE细胞的转变图3A：虽然在某些上皮病变(如乳腺癌)中已经证实了从LE细胞到BE细胞的转变，但在BPH中支持这一现象的证据有限。为了阐明BPH中从LE细胞向BE细胞转变的变化动力学，该研究构建了LE2和BE5细胞亚群的伪时间细胞轨迹(Fig. 3A)。图3B：进化树描述了从LE2到BE5的演变轨迹，并模拟了LE细胞向BE细胞的转化过程。LE2细胞分岔为fate 1或fate 2分支，其中fate 1分支导致LE2细胞向BE5细胞转变，而fate 2分支持续由LE2细胞组成（while fate 2 comprised of persisting LE2 cells）。因此，我们假设分支点1在决定LE细胞向BE细胞分化的过程中起关键作用。我们在这个分支点上分析差异基因（DEGs），发现这些差异基因在决定从root到fate 1或fate 2的转变中起着至关重要的作用。选择q<1e-04的DEG构建热图，并将其分为三个聚类(Fig. 3B)。基于Hallmark基因集（N=50）对每个聚类的DEG进行富集分析，发现在fate2中上调的聚类1中的差异基因在雄激素应答信号通路中表现出显著富集。相反，在fate1中上调的聚类2和聚类3中的差异基因在Hypoxia和EMT信号通路中显著富集。与Liu等人在乳腺癌中的研究结果一致的是，在BPH中从LE表型到BE表型的转变过程中也观察到EMT信号的显著增强。图3C：此外，本研究发现缺氧信号沿着fate 1的轨迹持续存在，而EMT信号则在进化树末端的细胞群中出现，提示缺氧在诱导EMT过程中发挥了作用(Fig. 3C)。这些发现表明，缺氧诱导的EMT在LE细胞向BE细胞转变过程中起着至关重要的作用。图3D+E+F+G：为了阐明结节形成过程中BE细胞发生变化的进化动力学，我们构建了BE5、BE6和BE7细胞亚群的伪时间细胞轨迹。进化树描述了从结节外初始细胞（BE5细胞）到负责结节形成的结节内主要末端细胞（BE6细胞）的转化过程（Fig. 3D）。BE5细胞的命运分化为两条路径:一部分沿着fate1轨迹转化为BE6细胞，另一部分沿着fate2轨迹，继续保持高FOS和JUN表达的BE5细胞。利用分支点1（branch point 1）的差异基因生成热图，其q值小于1e-04(图3E)。基于Hallmark基因集（N=50）的富集分析显示，在fate1中的簇2和簇6中上调的差异基因在EMT信号通路中表现出显著的富集。簇1和簇4中的差异基因在fate2中上调，在缺氧信号通路中显著富集。该研究进一步比较了命运1和根（fate1 and root）之间的缺氧和EMT信号。结果显示，与根相比，命运1细胞中EMT信号通路的激活明显更高; 然而，在命运支1和根细胞之间的Hypoxia信号通路水平没有显著差异。此外，我们比较了fate 2细胞和根之间的缺氧和EMT信号通路(图3F)。研究结果表明，与根细胞相比，fate 2细胞中缺氧信号通路的激活明显更高。然而，与fate 1细胞相比，我们观察到fate 2细胞中缺氧途径的激活明显较高，而EMT通路的激活较低。此外，与fate 1细胞相比，fate 2细胞检测到FOS和JUN的表达水平升高(图3G)。先前的研究表明，在缺氧条件下，AP-1复合体可以被激活，从而通过激活JNK或ERK信号通路促进细胞增殖。综上所述，我们认为在结节形成过程中，BE5细胞的一个特定亚群经历EMT并转化为最终供体（the end contributor）BE6细胞，而另一个以持续缺氧信号和高FOS和JUN表达为特征的不同亚群可能作为BE5细胞自我更新的储备库（serves as a reservoir for the self-renewal of BE5 cells）。 Figure3 使用scRNA-seq描述结节形成过程中上皮细胞变化的伪时间轨迹4. BE5细胞亚群促进良性前列腺增生（BPH）进展为了阐明BE5细胞亚群在BPH进展中的作用，本研究首先比较了来自BPH和正常组织样本的BE5细胞中特征基因FOS和JUN的表达水平。与来自正常组织样本的BE5细胞相比，BPH组织样本中的BE5细胞FOS基因表达显著升高，而JUN基因的表达则相对较低(Additional fle 1: Fig. S3A)。
图4A：虽然BPH组织中上皮细胞中BE5细胞的比例与正常组织中的BE5细胞比例相比没有显著差异（Wilcoxon test, p>0.05; Additional fle 1: Fig. S3B, C），但BPH组织中FOS+ BE5细胞的数量显著高于正常前列腺组织(chi-square test, p <0.0001; Fig. 4A)。与正常FOS+ BE5细胞相比，BPH FOS+ BE5细胞中FOS的表达水平显著升高（Wilcoxon test, p<0.0001;Fig. 4A）。GSEA分析结果显示，与其他BE细胞相比，BPH组织中的BE5细胞FOS转录活性增强，而JUN转录活性保持不变（Fig. S3D, E）。这些结果凸显了BE5细胞中FOS表达与BPH之间的密切关系。为了进一步研究这种联系，进行了临床组织学实验。免疫荧光（IF）和免疫组化（IHC）结果显示，由FOS编码的c-Fos蛋白在前列腺组织的LE细胞和BE细胞中均有表达；但在BPH组织的BE细胞中表达更为明显(Additional fle 1: Fig. S4A, B)。c-Fos的表达水平与缺氧标志蛋白HIF-1α的表达水平呈显著正相关(r = 0.80, p = 5.1e-3;附加文件1:图S4C)。此外，与c-Fos表达相对较低的BPH组织相比，c-Fos高表达的上皮细胞增殖标志蛋白PCNA表达显著上调(t检验:p = 0.03;附加文件1:图S4D)。这些发现进一步支持了BPH组织中以FOS表达升高和缺氧为特征的BE5细胞亚群的存在。此外，c-Fos表达与细胞增殖之间存在显著正相关，强调了BE5细胞亚群在自我更新方面的潜在能力。图4B+C：此外，通过整合BPH患者的医学影像学检查数据，我们利用前列腺体积和IPP等指标阐明了c-Fos表达与BPH临床症状的严重程度和进展之间的相关性，发现c-Fos表达水平与前列腺体积显著正相关(r = 0.81, p = 0.003;图4B, C)，同时也表明高IPP程度(> 10 mm)的患者比低IPP程度(≤10 mm)的患者具有更高的C - fos表达(t检验:p = 2.7e−3;附加文件1:图5)。值得注意的是，IPP与前列腺体积增加、阻塞性症状加重和尿流量峰值降低有显著相关性，因此在症状评估和进展预测方面具有客观的临床应用价值。这些发现共同强调了BE5细胞在前列腺增生中所起的关键作用。图4D：此外，根据组成细胞类型的不同，增殖性结节可分为间质结节和腺性结节。间质结节主要由间质组成，腺性结节主要由腺上皮组成。然而，值得注意的是，这两种增生性结节的两种表型经常共存于同一个肥大的前列腺中，这意味着它们形成的过程之间存在潜在的相互关系。在本研究中，我们旨在从BE5细胞的角度来阐明这一现象。我们最初使用Hallmark基因集收集(N = 50)对正常、腺结节(BPH_GN)和间质结节(BPH_SN)组织的BE5细胞亚群进行ssGSEA，以研究它们的功能。我们观察到BPH_GN和BPH_SN的BE5细胞亚组中EMT信号显著上调，BPH_GN的BE5细胞亚组中缺氧和细胞增殖（Hypoxia and cell proliferation）相关信号通路显著上调(图4D)。研究结果表明，在间质结节中，BE5亚群主要在EMT中起作用，同时由于其缺氧信号的上调，在细胞增殖和腺结节内的EMT中起着重要作用。图4E：此外，我们构建了正常、BPH_GN和BPH_SN的BE5细胞亚群的拟时序细胞轨迹，以模拟BE5细胞在间质和腺结节形成过程中的变化。进化树描述了BE5细胞在两种类型BPH进展过程中功能的连续变化(图4E)。正常的BE5细胞在分支点3发生分叉，产生fate 1或fate 2分支。Fate 1导致正常BE5细胞向BPH_SN BE5细胞转变，Fate 2导致正常BE5细胞向BPH_GN BE5细胞转变。图4F：我们在分支点3处分析了差异基因，分支点3表现出从根到命运1或命运2的不同转变模式(图4F)。基于Hallmark基因集(N = 50)进行富集分析，发现fate 2中上调的差异基因在雄激素反应和雌激素反应（Androgen response and Estrogen response）的早期和晚期信号通路中显著富集。相反，fate 1中上调的差异基因证明缺氧和EMT信号通路显著富集。图4G：缺氧和细胞增殖相关通路的信号在fate 2的末端增强，而EMT的信号在两个细胞命运的两端都增强(图4G)。本研究结果进一步证明了BE5主要参与间质结节形成过程中的EMT，同时也强调了其在腺结节形成过程中对缺氧诱导的细胞增殖和EMT中的作用。此外，分支点3的前3个差异基因分别是SCGB1A1、LTF和MMP7。这些差异基因在fate 2中表达上调，而在fate 1中表达下调，这表明腺结节中的BE5细胞表现出明显的棒状（club-like）特征(附加文件1:图S6)。
Supplementary Figure S3. BPH组织中存在BE5亚群的特征。 Supplementary Figure S4 湿实验验证BPH组织中FOS的定位和表达 
Figure4 BE5细胞亚组促进BPH进展 
Supplementary Figure S6. 正常、BPH_GN和BPH_SN BE5细胞在拟时序细胞轨迹中的分支点3处，前四个DEG沿两个细胞命运的动态表达的点图。
前列腺增生（BPH）是一种常见的老年男性疾病，其发生机制复杂且涉及多种细胞类型及信号通路。为了解BPH的发病机制，本研究利用单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据结合空间转录组（ST）分析，识别并注释了前列腺组织中的多种细胞类型及其亚群。通过探讨不同细胞群的空间分布、基因表达特征以及相关信号通路的变化，为BPH的发病机制研究提供了新的视角，并可能为该病的临床治疗提供理论基础。CNSKnowall生信文献解读特色：①对原文的所有结果部分采用人工精准逐字逐句翻译，一句不落，以帮助粉丝们全面了解全文的所有研究结果，不放过任何一处细节，高效掌握其核心思路和研究精髓！②全文的主图以及所有附图都会放在推文中，大家只需要看本推文即可全面了解全文研究内容！③人工总结超详细的全文研究路线流程图，帮助读者增强科研思维和研究方案设计能力！ |
