前列腺
上皮
由两种主要细胞群组成:腔上皮(LE)细胞和基底上皮(BE)细胞，LE和BE细胞的相互作用及其增生是前列腺增生的关键机制之一，了解这种关系有助于开发针对BPH的治疗策略。在今天这篇解读的文章是今年
4月最新
发表在《Journal of Translational Medicine》（IF=
6.1
，中科院2区）杂志上的
干湿结合
的生信文章中，作者分析了良性前列腺增生（Benign prostatic hyperplasia，
BPH
）增生性结节形成过程中从LE细胞表型到BE细胞表型的转变，并
确定了一个独特的BE细胞亚群--称为BE5
，在推动这一进程中发挥了关键作用。通过系列生信分析和对收集的
9例BPH患者组织临床样本进行免疫荧光（IF）和免疫组化实验（IHC）
，证明BPH患者中
BE5细胞亚群的显著特征是缺氧加剧和FOS表达上调
，该亚群不仅在结节形成过程中起起始细胞作用，而且在
LE细胞表型向BE细胞表型转化
过程中起过渡细胞作用。
考虑到大家科研任务繁重，为了便于读者朋友快速理解全文，节省宝贵时间，小编特意花了一天时间阅读和总结全文后精心DIY制作了一份清晰的研究路线图，多看研究路线图可以强化科研思维，提高研究方案设计能力，始于模仿，成于创新！
本篇文章的研究思路精简如下(全文用到的生信方法标注成红色)：
①采用稳健细胞类型分解（RCTD）
方法整合自测的1例BPH患者空间转录组测序数据和来自GEO公共数据库的12例单细胞RNA测序数据，发现四个上皮细胞亚群分布在不同的结节区域内外，后续研究围绕上皮细胞亚群开展
。
②
进一步将
上皮细胞亚群细分
为8个BE亚群和2个LE亚群，并通过
RCTD
方法在ST切片内精确定位这些亚群后比较其在结节区域内外的细胞数量差异，证明在在结节形成过程中出现BE细胞数量增加，LE细胞数量减少的现象，后续研究聚焦在LE和BE两个上皮细胞亚群。
③
随后进行
ssGSEA通路富集
分析发现BE细胞亚群中（尤其是BE5）缺氧和EMT信号通路都显著上调并存在正相关性，
IHC染色
证明收集的9例BPH临床组织中EMT标志物（Vimentin、E-cadherin）和缺氧标志物（HIF-1α）发生了跟生信分析结果一致的变化，从而将BE5视为结节形成的最初BE细胞亚群。
④
对上皮细胞亚群进行
拟时序分析
发现从结节外的LE2上皮亚群到结节内的BE6亚群发育过程中出现缺氧、EMT和细胞增值信号通路的增强，BE5细胞是结节外到结节内发育过程中的核心亚群，
后
续研究聚焦到BE5细胞亚群，通过系列生信分析、BPH临床医学影像学数据和实验证明为BE5细胞亚群通过缺氧有道EMT和细胞增殖以促进BPH进展。
这篇文章的分析方法总体比较基础，内容组成为
90%生信分析+10%的临床样本收集和免疫组化实验验证
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表1 数据来源
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数据集/队列
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数据库
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数据类型
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样本具体信息
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GSE17235
7
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GEO
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scRNA-seq
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正常前列腺组织（n=3）、良性结节组织（n=5）、良性前列腺基质结节（n=4
）
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GSE24224
9
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GEO
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自测空间转录组（ST
）
|
良性前列腺增生（BPH）患者（n=1）的前列腺组织空间转录数据
|
研究背景
：增生性结节性病变是良性前列腺增生（BPH）的典型病理特征，是导致前列腺体积增加并引发下尿路症状（LUTS）的主要原因。尽管已有研究表明多种细胞过程参与了BPH的发生和发展，且特别强调了上皮细胞在增生结节形成中的关键作用，但其具体机制仍未完全阐明。然而，技术上的局限性使得对BPH患者进行体内研究面临挑战。
研究方法
：采用稳健细胞类型分解（RCTD）方法整合空间转录组学和单细胞RNA测序谱，从而阐明结节形成过程中上皮细胞的改变。采用免疫荧光染色和免疫组化染色进行验证。
创新点
：
采用空间转录组（ST）技术能够在整个组织切片的结构内提供全面的空间基因表达图谱，这项技术可以有效克服传统技术的局限性。当与单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术相结合时，能够对组织结构中的细胞变化进行表征，并有助于阐明不同细胞群体与组织结构之间的功能联系。因此，本研究通过联合应用
空间转录组和
单细胞RNA测序技术
旨在通过模拟BPH中增生性结节形成的过程，全面理解上皮细胞的变化及其功能。这将有助于发现
BPH
新的治疗靶点。
|
1.
ST通过与scRNA - seq技术相结合识别BPH组织中不同细胞类型的空间特征
该研究利用12个样本的scRNA-seq数据
来明确前列腺组织中的不同细胞类型
(Additional fle 1: Table S3)。基于基因表达，共识别出了16个细胞群。
根据已确定的标记基因，共84,835个细胞
被注释为
上皮细胞
、
间质细胞
（内皮细胞、纤维细胞和平滑肌细胞）以及
免疫细胞
（T细胞、髓系细胞、浆细胞、肥大细胞和B细胞）。
PTPRC−
和
EPCAM+
簇被鉴定为高表达
KRT8
和
KRT18
的上皮细胞。PTPRC+簇被鉴定为免疫细胞。其中，
CD3D、IL7R、CD8A、CD8B高表达的细胞簇被注释为T细胞
；
APOE、LYZ、IL1B高表达的
细胞簇被注释为
髓系细胞；MZB1高表达的聚类代表浆细胞
。其余两个P
TPRC+簇被注释为表达CPA3、KIT和TPSAB1的肥大细胞
，以及
表达MS4A1、CD22和CD79A的B细胞群
。
PTPRC−和EPCAM−簇被鉴定为基质细胞
，由表达CLDN5、SELE和PECAM1的
内皮细胞
（Endo），表达C1S、DCN和C7的
纤维细胞
（Fib）和表达ACTA2、MYH11、RGS5的
平滑肌细胞
（SMC）组成 (Additional fle 1: Fig. S1D, E)。
每组注释细胞类型的UMAP如图所示
（Additional fle 1: Fig. S1F）。
对每种细胞类型的前三个代表性基因进行鉴定验证了这些细胞的准确注释
（Additional fle 1: Fig. S1G）。
图1A+B：
通过对由2945个spots组成的BPH样本进行
空间转录组（Spatial transcriptomic，ST）
分析，评估不同细胞类型的空间分布
。
BPH样本的ST部分采用苏木精-伊红（H&E）染色进行了组织学染色分析
（
Fig. 1A）。基于ST测序数据，空间斑点(
the spatial spots)
可分为7个不同的簇(C0-C6)(Fig. 1A, B)。
图1C+D+E：
采用稳健细胞类型分解(Robust Cell Type Decomposition，RCTD)方法将ST和scRNA-seq分析的结果进行整合，从而识别出每个空间亚群中的主要细胞类型
（Fig. 1C–E）。以纤原纤维细胞为主的C0为纤原纤维（Fib）簇，分布于结节区内外。C6被确定为免疫细胞群，因为其B细胞和髓系细胞比例较高，并主要分布在结节区域外。
图1F：
值得注意的是，
发现了4个以上皮细胞为主要成分的上皮簇（C1、C2、C3和C5），主要定位于腺上皮区域
。
C1斑点主要分布在结节区域内
，而C
2、C3和C5斑点则主要分布在结节区域外
(Fig. 1F)。表明这些
上皮细胞在结节形成过程中具有不同的功能作用。
Fig.S1
. 前列腺组织单细胞和空间转录组图谱(n=13)
Figure1 前列腺组织中不同细胞类型的空间特征
Supplementary Table S
3:
ST和单细胞RNA测序所用样本的基本信息
2.
ST结合scRNA - seq技术能够识别BPH组织中不同上皮亚型的空间特征
为了阐明上皮细胞在结节形成中的作用，作者首先使用scRNA-seq数据进行了基于图（graph-based）的亚聚类分析，以识别不同的上皮细胞亚群
。通过使用一项从先前研究中
正常前列腺组织单细胞转录组谱
开发的
特征基因集分析差异
表达基因（DEGs）
和特征
评分
，来鉴定
细胞类型
(Additional fle 1: Fig. S2A, B)。
图2A：
鉴定到
8个BE细胞亚群
、
2个LE细胞亚
群
、
1个Club细胞亚
群
和
1个Hillock细胞亚
群
（Figure 2A）。
BE特征评分和KRT5、KRT14和KRT15表达显著上调的细胞群被归类为BE细胞
。同样，L
E特征评分显著升高伴随KLK2、KLK3和ACPP表达显著升高的细胞群被标记为LE细胞
。此外，
LE和BE评分相对较低但Club细胞标记基因(SCGB3A1、PIGR、MMP7、CP和LCN2)和Hillock细胞标记基因(KRT13、SERPINB1和CLDN4)表达水平较高的细胞群被定义为Club和Hillock细胞
。
图2B+C+D：
随后
采用RCTD方法在ST切片内精确定位这些亚群
(Additional fle 1: Fig. S2C)。
与结节外区相比，结节内BE细胞比例较高，LE细胞比例较低
(Fig. 2B)。与结节区域外相比，结节区域内的LE权重与BE
权重
的比值显著降低(Fig. 2C)。这些结果表明，
在结节形成过程中，BE细胞数量增加，LE细胞数量减少
。LE细胞亚群方面，
LE1细胞亚群主要分布于BPH组织C5上皮区域内
，主要位于结节区。相比之下，
BPH组织内C1和C2空间上皮区的LE2细胞亚群主要分布在结节区外
(Fig. 2D; Additional fle 1: Fig. S2D,E)。
图2E：
为了研究这两个LE细胞亚群的功能作用
，
该研究使用了Hallmark基因集（N=50）对LE1与LE2细胞亚群进行了ssGSEA分析
。
该研究特别关注了与BPH密切相关的几个Hallmark通路
，包括
雄激素响应通路
、
上皮间质转化（EMT）通路
以及
与细胞增殖相关的通路
（包括DNA修复通路、E2F靶点通路、G2M检查点通路和有丝分裂纺锤体通路）。该研究观察到
LE1细胞亚群中存在显著上调的EMT（上皮间质转化）现象
，而Androgen Response信号通路则出现下调；而在LE2细胞亚群中，则观察到了相反的模式（Fig. 2E）。
图2F：
在BE细胞亚群中，即BE1、BE4、BE6、BE7和BE8，它们在BPH组织中的分布主要集中在结节区域。值得注意的是，与其他BE细胞亚组相比，在大多数这些亚组（BE1、BE4和BE6）中均观察到EMT信号通路的显著上调（Fig. 2F）。BE6细胞亚群所表现出的细胞增殖增强尤其值得注意，因为这表明它们在结节形成过程中可能起到最终供体细胞（
end contributor cells）的作用。相反，BE3 和 BE5 细胞亚群主要分布在结节区域外。值得注意的是，与其他BE细胞亚组相比，这两个亚组的EMT信号均显著下调(Fig. 2F)，因此与在LE细胞结节形成过程中观察到的EMT信号的改变相一致。
然而，这两个亚组之间的增殖能力有显著差异。
在前列腺组织中，C2和C3空间上皮区域的BE3细胞表现出增强的增殖能力，而C3和C5空间上皮区域的BE5细胞则未显示出类似效应
(Additional fle 1: Fig. S2D,E; Fig. 2D, F)。
有趣的是，
作者观察到缺氧信号的显著增强
，特别是在BE5细胞群中。缺氧诱导的EMT已被广泛报道用于各种恶性肿瘤，包括胶质瘤、前列腺癌、卵巢癌、肺癌和肝细胞癌。
此外，
作者已发表的先前研究已证明了EMT的关键参与和缺氧诱导良性前列腺增生（BPH）
上皮间充质转化（EMT）
的能力
。本研究还
观察到缺氧与上皮细胞EMT之间存在显著的正相关(附加文件1:图S2F)。
上皮间充质转化（EMT）
的过程与上皮细胞功能(如E-cadherin表达)的丧失和间充质细胞功能(如vimentin表达)的增加有关。
免疫组织化学染色结果
显示，
BPH组织中Vimentin（r=0.68，p=0.03）表达上调和E-cadherin（r=-0.84，p=0.02）表达显著下调，同时伴有HIF-1a（缺氧标志物蛋白）的上调
(Additional fle 1: Fig. S2G)。因此，本研究提出缺氧是诱导上皮间充质转化（EMT）的触发因素，其中
BE5细胞亚群表现出缺氧信号通路上调，是参与结节形成的最初BE细胞群
。
图2G：
为了进一步阐明前列腺上皮线谱系的进化动力学动态，作者对12个不同的上皮细胞亚群进行了伪时间细胞轨迹分析
。
基于结节内外细胞群的分布，将LE2细胞亚群确定为这一进化轨迹曲线的独特初始点。然后生成了从结节外上皮细胞到结节内上皮细胞以及从LE细胞到BE细胞的发育轨迹
(Fig. 2G)。
图2H：
该研究的主要目的是研究从主要位于结节区域外的LE2亚群到主要位于结节区域内的结节形成末端效应器（nodular formation end effector）BE6亚群（Fig. 2G; Additional fle 1: Fig. S2H）的发育路径，发现缺氧、EMT和细胞增殖信号通路增强(Fig. 2H)。作者
观察到缺氧信号上调的
BE5细胞【
其特征是高水平表达FOS和JUN
(Additiona
l
fle 1:Fig. S2I)】
不仅在结节形成过程中发挥启动BE细胞的作用，而且在LE向BE细胞转化过程中起过渡中间体的作用
。
FOS和JUN基因编码FOS和JUN蛋白家族，形成异二聚体复合体，称为激活蛋白-1 (AP-1)，发挥转录因子的作用。从
Transcrip-tional Regulatory Relationships Unraveled by Sentence-based Text mining v2 (TRRUST v2) database
中获得的fos-靶因子基因集和jun-靶因子基因集（FOS-target factor gene set and JUN-target factor gene set）进行基因集富集分析(GSEA)
。结果表明，与其他BE细胞相比，BE5细胞中目标因子基因集的表达显著上调（Additional fle 1: Fig. S2J, K），这说明
BE5细胞具有更强的AP-1转录活性
。
Figure2 上皮细胞的亚群分析
Supplementary Figure S2.上皮细胞的亚群分析
3.拟时序
细胞轨迹描述了从LE到BE细胞的转变，以及从结节外BE细胞到结节内BE细胞的转变
图3A：
虽然在某些上皮病变(如乳腺癌)中已经证实了从LE细胞到BE细胞的转变，但在BPH中支持这一现象的证据有限
。
为了阐明BPH中从LE细胞向BE细胞转变的变化动力学，该研究构建了
LE2和BE5细胞亚群的
伪时间细胞轨迹
(Fig. 3A)。
图3B：
进化树描述了从LE2到BE5的演变轨迹
，
并模拟了LE细胞向BE细胞的转化过程
。
LE2细胞分岔为fate 1或fate 2分支，其中fate 1分支导致LE2细胞向BE5细胞转变，而fate 2分支持续由LE2细胞组成（while fate 2 comprised of persisting LE2 cells）。
因此，我们假设分支点1在决定LE细胞向BE细胞分化的过程中起关键作用。我们在这个分支点上分析差异基因（DEGs），发现这些差异基因在决定从root到fate 1或fate 2的转变中起着至关重要的作用。
选择
q
<1e-04的DEG构建热图
，并将其分为三个聚类(Fig. 3B)。
基于Hallmark基因集（N=50）对每个聚类的
DEG
进行富集分析
，发现在fate2中上调的聚类1中的差异基因在雄激素应答信号通路中表现出显著富集。相反，
在fate1中上调的聚类
2和
聚类
3中的差异基因
在
Hypoxia
和EMT信号通路中显著富集
。
与Liu等人在乳腺癌中的研究结果一致的是，在BPH中从LE表型到BE表型的转变过程中也观察到EMT信号的显著增强。
图
3C
：
此外，本研究发现缺氧信号沿着fate 1的轨迹持续存在，而EMT信号则在进化树末端的细胞群中出现，提示缺氧在诱导EMT过程中发挥了作用(Fig. 3C)。这些发现表明，缺氧诱导的EMT在LE细胞向BE细胞转变过程中起着至关重要的作用。
图3D+E+F+G：
为了阐明结节形成过程中BE细胞发生变化的进化动力学，我们构建了BE5、BE6和BE7细胞亚群的伪时间细胞轨迹。
进化树描述了从结节外初始细胞（BE5细胞）到负责结节形成的结节内主要末端细胞（BE6细胞）的转化过程
（Fig. 3D）。
BE5细胞的命运分化为两条路径:一部分
沿着fate1轨迹
转化为BE6细胞，另一部分沿着
fate
2轨迹，继续保持高FOS和JUN表达的BE5细胞。利用分支点1（branch point 1）的差异基因生成热图，其q值小于1e-04(图3E)。
基于Hallmark基因集（N=50）的富集分析显示，在
fate
1中的
簇2和簇6中
上调的差异基因在EMT信号通路中表现出显著的富集。簇1和簇4中的差异基因在
fate
2中上调，在缺氧信号通路中显著富集。
该研究进一步比较了命运1和根（fate1 and root）之间的缺氧和EMT信号。结果显示，与根相比，命运1细胞中EMT信号通路的激活明显更高; 然而，在命运支1和根细胞之间的Hypoxia信号通路水平没有显著差异。
此外，我们比较了fate 2细胞和根之间的缺氧和EMT信号通路(图3F)。
研究结果表明，与根细胞相比，fate 2细胞中缺氧信号通路的激活明显更高。然而，与fate 1细胞相比，我们观察到fate 2细胞中缺氧途径的激活明显较高，而EMT通路的激活较低。此外，与fate 1细胞相比，fate 2细胞检测到FOS和JUN的表达水平升高(图3G)。先前的研究表明，在缺氧条件下，AP-1复合体可以被激活，从而通过激活JNK或ERK信号通路促进细胞增殖。综上所述，我们认为
在结节形成过程中，BE5细胞的一个特定亚群经历EMT并转化为最终供体（the end contributor）BE6细胞，而另一个以持续缺氧信号和高FOS和JUN表达为特征的不同亚群可能作为BE5细胞自我更新的储备库
（serves as a reservoir for the self-renewal of BE5 cells）。
Figure3 使用scRNA-seq描述结节形成过程中上皮细胞变化的伪时间轨迹
4. BE5细胞亚群促进良性前列腺增生（BPH）进展
为了阐明BE5细胞亚群在BPH进展中的作用，本研究首先比较了来自BPH和正常组织样本的BE5细胞中特征基因FOS和JUN的表达水平
。
与来自正常组织样本的BE5细胞相比，BPH组织样本中的BE5细胞FOS基因表达显著升高
，
而JUN基因的表达则相对较低
(Additional fle 1: Fig. S3A)
。
图4A：
虽然BPH组织中上皮细胞中BE5细胞的比例与正常组织中的BE5细胞比例相比没有显著差异
（Wilcoxon test,
p>0.05; Additional fle 1: Fig. S3B, C）
，但BPH组织中
FOS+
BE5细胞的数量显著高于正常前列腺组织
(chi-square test, p <0.0001; Fig. 4A)
。
与正常
FO
S
+ BE5细胞相比，BPH
FOS
+ BE5细胞中
FOS
的表达水平显著升高
（
Wilcoxon test,
p
<0.0001;Fig. 4A）
。
GSEA分析结果显示，与其他BE细胞相比，BPH组织中的BE5细胞FOS转录活性增强，而JUN转录活性保持不变
（
Fig. S3D, E）
。
这些结果凸显了
BE5细胞中FOS表达与BPH之间的密切关系。
为了进一步研究这种联系，进行了
临床组织学实验。免疫荧光（IF）和免疫组化（IHC）
结果显示，
由FOS编码的c-Fos蛋白在前列腺组织的LE细胞和BE细胞中均有表达；但
在BPH组织的BE细胞中表达更为明显
(Additional fle 1: Fig. S4
A, B)。
c-Fos的表达水平与缺氧标志蛋白HIF-1α的表达水平呈显著正相关(r = 0.80, p = 5.1e-3;附加文件1:图S4C)。
此外，与c-Fos表达相对较低的BPH组织相比，c-Fos高表达的
上皮细胞增殖标志蛋白PCNA表达
显著上调(t检验:p = 0.03;附加文件1:图S4D)。
这些发现进一步支持了BPH组织中以FOS表达升高和缺氧为特征的BE5细胞亚群的存在。
此外，
c-Fos表达与细胞增殖之间存在显著正相关，强调了BE5细胞亚群在自我更新方面的潜在能力
。
图4B+C：
此外，通过整合BPH患者的医学影像学检查数据，我们利用前列腺体积和IPP等指标阐明了c-Fos表达与BPH临床症状的严重程度和进展之间的相关性，发现
c-Fos表达水平与前列腺体积显著正相关(r = 0.81, p = 0.003;图4B, C)，同时也表明高IPP程度(> 10 mm)的患者比低IPP程度(≤10 mm)的患者具有更高的C - fos表达(t检验:p = 2.7e−3;附加文件1:图5)。
值得注意的是，IPP与前列腺体积增加、阻塞性症状加重和尿流量峰值降低有显著相关性，因此在症状评估和进展预测方面具有客观的临床应用价值。这些发现共同强调了BE5细胞在前列腺增生中所起的关键作用。
图4D：
此外，根据组成细胞类型的不同，增殖性结节可分为间质结节和腺性结节。间质结节主要由间质组成，腺性结节主要由腺上皮组成。
然而，值得注意的是，这两种增生性结节的两种表型经常共存于同一个肥大的前列腺中，这意味着它们形成的过程之间存在潜在的相互关系。在本研究中，我们旨在从BE5细胞的角度来阐明这一现象。
我们最初使用Hallmark基因集收集(N = 50)对正常、腺结节(BPH_GN)和间质结节(BPH_SN)组织的BE5细胞亚群进行ssGSEA，以研究它们的功能。我们观察到
BPH_GN和BPH_SN的BE5细胞亚组中EMT信号显著上调，BPH_GN的BE5细胞亚组中缺氧和细胞增殖（Hypoxia and cell proliferation）相关信号通路显著上调(图4D)
。
研究结果表明，
在间质结节中，BE5亚群主要在EMT中起作用，同时
由于其缺氧信号的上调，在细胞增殖和腺结节内的EMT中起着重要作用。
图4E：
此外，我们构建了正常、BPH_GN和BPH_SN的BE5细胞亚群的拟时序细胞轨迹，以模拟BE5细胞在间质和腺结节形成过程中的变化。进化树描述了BE5细胞在两种类型BPH进展过程中功能的连续变化(图4E)。正常的BE5细胞在分支点3发生分叉，产生fate 1或fate 2分支。Fate 1导致正常BE5细胞向BPH_SN BE5细胞转变，Fate 2导致正常BE5细胞向BPH_GN BE5细胞转变。
图4F：
我们在分支点3处分析了差异基因，
分支点3
表现出从根到命运1或命运2的不同转变模式(图4F)。
基于Hallmark基因集(N = 50)进行富集分析，发现fate 2中上调的差异基因在雄激素反应和雌激素反应（Androgen response and Estrogen response）的早期和晚期信号通路中显著富集。
相反，
fate 1中上调的差异基因证明缺氧和EMT信号通路显著富集。
|
