摘
要：
目的
总甘草素是甘草苷在体内的主要暴露形式，对两者在大鼠体内暴露特征及体外跨膜转运机制进行研究，为以甘草苷单体为新药的进一步开发提供依据。
方法
采用
LC-MS/MS
分析方法测定大鼠给药后不同时间点血浆样品中的总甘草素浓度，并应用
WinNonlin.6.3
软件采用非房室模型的统计矩法计算药代动力学参数；同时测定大鼠
ig
给药后组织匀浆中的浓度，考察不同类型甘草素在各组织中的暴露特征；应用体外
MDCK-MDR1
细胞模型，研究甘草苷、甘草素的跨膜转运能力及其机制。
结果
ig
给药后在大鼠体内，甘草苷不呈线性动力学特征；血浆和大部分组织中主要以甘草素的
II
相结合产物存在，肝、子宫、卵巢、胃和肠组织中主要为游离甘草素；总甘草素暴露量排序为肠＞血浆＞肝＞肾＞肺＞胃＞子宫＞卵巢＞脂肪＞心＞脾＞肌肉＞睾丸，且不易产生组织蓄积现象；甘草素跨膜转运能力较甘草苷良好，且均不是
P-gp
转运体的底物。
结论
甘草苷不呈线性动力学吸收特征；甘草素在组织中暴露特征表现为不同组织中甘草素的存在形式和分布程度差异较大，总甘草素不易产生组织蓄积现象；两者均为被动扩散跨膜转运方式。
甘草为豆科植物甘草
Glycyrrhiza uralensis
Fisch.
、胀果甘草
G. inflata
Bat.
及光果甘草
G. glabra
L.
的干燥根及根茎；其性味甘平，归心、肺、脾、胃经，具有补脾益气、清热解毒、祛痰止咳、缓急止痛、调和诸药的功效
[1]
。甘草的现代药理研究显示其具有抗炎、抗菌、保肝、抗氧化、抗癌、降糖、免疫调节等多种药理作用
[2-3]
。甘草的主要活性成分有三萜类、黄酮类、多糖类
[4]
，具有广泛的生物活性。目前，甘草属中分离得到的黄酮类化合物及其衍生物有
300
多种
[5]
，具有抗菌、抗病毒、保肝、抗肿瘤等药理作用。甘草苷是甘草中主要的黄酮类化合物，本课题组前期研究发现大鼠单次
ig 30
、
100 mg/kg
甘草苷后具有显著的抗垂体后叶素诱导的心肌缺血作用，表现为抑制心电图
J
点变化。因此，甘草苷拟作为抗心肌缺血
Ⅰ
类新药进行开发研究。
通过药物代谢和药动学研究药物的体内处置和动力学过程，将药物在血循环和靶器官的暴露水平与关键的临床表现（药效和不良反应）相关联，为了解动物或人体服用药物后的生物学和物理化学过程及机制提供科学依据
[6]
。已有文献报道提示，甘草素是甘草苷在体内的代谢产物之一，甘草苷进入体内主要是以甘草素的形式被吸收
[7-10]
。为了确定甘草苷经口给药后在体内的主要暴露形式，本研究首先进行了一系列预实验。结合药效学的给药方式和有效剂量，大鼠单次
ig
给予
30 mg/kg
甘草苷后大鼠血浆中检测到少量甘草苷（最高血药浓度约为
50 ng/mL
），而血浆中总甘草素平均最高浓度为（
3.166
±
1.616
）
μg/mL
，研究结果提示甘草苷原型
不是甘草苷胃肠道给药后在体内的主要存在形式
[10]
，
同时血浆中总甘草素（包括游离甘草素、甘草素硫酸结合物、甘草素葡萄糖醛酸结合物）的暴露量远远大于游离甘草素的暴露量。吸收和分布是药物进入机体到达作用部位的重要过程，药物吸收的多少及快慢直接影响到
药物在体内发挥的作用
[11]
。其中药物的吸收过程与转运密切相关，且甘草有“解百药毒”的特性
[12]
，其机制之一为延缓和减少药物吸收，目前也有研究表明甘草这一特性与其跨膜转运功能有关
[13]
。基于此，本研究以含有葡萄糖醛酸酶和硫酸酯酶的
H-2
型水解酶，测定未经水解及酶水解后样品中甘草素的含量表征游离甘草素和总甘草素，定量分析两者在大鼠体内的吸收动力学、组织分布速度和程度及消除特点，总结归纳暴露特征，从而间接表征甘草苷在大鼠体内的动态变化；以甘草苷和甘草素为待测物分别评价其跨膜转运能力、探究跨膜转运机制等，为甘草苷的进一步研究开发提供参考数据。
1
材料
1.1
药品与试剂
甘草苷（批号
20121211
，质量分数为
98.23%
）、甘草素（批号
20120401
，质量分数为
100%
），吉林省中医药科学院；柚皮素（批号
071100023
，质量分数为
99.2%
），河南天方药业有限公司；羧甲基纤维素钠（分析纯）、
N
-
甲基
-
吡咯烷酮（分析纯）、甲酸（色谱纯）、甲酸铵（分析纯），天津市光复精细化工研究所；无水乙醇（分析纯），天津市化学试剂供销公司；甲醇（色谱纯）、冰乙酸（色谱纯），天津康科德科技有限公司；
β-
葡萄糖醛酸酶（
Type H-2 From Helix Pomatia
，批号
011M7405
），
SIGMA-ALDRICH
公司；磷酸二氢铵（分析纯），天津市化学试剂三厂；肝素钠注射液（批号
20111006
），天津市生物化学制药厂；
DMEM
培养基（批号
NYM1045
），美国
Hyclone
公司，使用前
4
℃保存；胎牛血清（批号
1227693
），美国
Gibco
公司，使用前
−25
℃保存；
Trypsin-EDTA
（批号
1155732
），美国
Gibco
公司，使用前
4
℃保存；超纯水，实验室自制。
1.2
实验动物
SPF
级健康
Wistar
大鼠，雌雄各半，
7
～
10
周龄，体质量
200
～
300 g
。北京市维通利华实验动物科技有限公司提供，生产单位许可证编号：
SCXK
（京）
2012-0001
，动物质量合格证编号：
No.11400700015112
、
No.11400700018465
。本研究的动物使用方案已经获得天津市新药安全评价研究中心
IACUC
批准，
IACUC
号为
2013071901
。
1.3
仪器
液相色谱系统（配备
LC-20AD
型输液泵、
DGU-20A3
型脱气机、
CTO-20A
型柱温箱、
SI L-20A
型自动进样器、
CBM-20A
系统控制），日本
Shimadzu
公司；
Diamonsil
®
C
18
色谱柱（
150mm
×
4.6 mm
，
5 µm
），
Dikma
科技公司；质谱系统（配备
API 4000 Q-TRAP
质谱仪，
ESI
（电喷雾离子化）离子化源和
Analyst 1.5.2
分析数据处理系统工作站），美国
Applied Biosystems
公司；
17R
台式高速冷冻离心机
，美国
Thermo Scientific
公司；
Turbo Vap LV
型样品浓缩仪，美国
Caliper
公司；
700E
型全自动均质器，美国
TOMTEC
公司；
BM-40
型纯水制备系统，北京中盛茂源科技发展有限公司；
Eppendorf
手动单道加样器，德国
Eppendorf
公司；
ZHWY-110X50
型恒温水浴震荡仪，上海智城分析仪器制造有限公司；
IMS-40
全自动雪花制冰机制冰机，常熟市雪科电器有限公司；
Olympus- CKX41
倒置显微镜，日本
Olympus
公司；二氧化碳培养箱，美国
Thermo
公司；
Millcell ERS-2
跨上皮电阻仪，美国
Millipore
公司；
12
孔聚碳酸酯膜转运（
Transwell
®
），美国
Corning
公司；单人超净工作台及生物安全柜，力康生物医疗有限科技公司。
2
方法
2.1
LC-MS/MS
条件
2.1.1
色谱条件
色谱柱为
Diamonsil
®
C
18
（
150 mm
×
4.6mm
，
5 µm
）；柱温
40
℃
；流动相为甲醇（
A
）
-
0.5 mmol/L
甲酸铵溶液（含
0.2%
甲酸和
10%
甲醇，
B
）
（
52.5
∶
47.5
）
；体积流量
0.6 mL/min
；进样体积为
3 µL
；运行时间为
10 min
（
5
～
9.8 min
切换进入质谱）。
2.1.2
质谱条件
ESI
电喷雾离子源，离子喷雾电压
−3000 V
；温度
500
℃
；喷雾气
344.74 kPa
（
50 psi
）；加热气
551.60 kPa
（
80 psi
）；卷帘气
68.95 kPa
（
10 psi
）；碰撞气
55.16 kPa
（
8 psi
）；负离子方式检测，扫描模式为多反应监测（
MRM
）；甘草素碰撞能量为
−40 V
，内标物柚皮素碰撞能量为
−25 V
；甘草素
m
/
z
为
255.0
～
119.0
；内标物柚皮素
m
/
z
为
271.0
～
151.0
。
2.2
吸收动力学
2.2.1
给药溶液的配制
单次
ig
给药：准确称量甘草苷
120
、
240
、
480 mg
，在乳钵中研磨状态下缓缓加入
0.5%
羧甲基纤维素钠
20 mL
，分别制成
6
、
12
、
24 mg/mL
的药液。
iv
给药：准确称量甘草苷
150 mg
，在乳钵中研磨状态下缓缓加入
2 mL
N
-
甲基吡咯烷酮，再加
1 mL
无水乙醇，完全溶解后，加入
7 mL
生理盐水，混匀，制成
15 mg/mL
的药液。
2.2.2
动物给药
单次
ig
给药：健康
Wistar
大鼠
18
只，体质量（
245
±
25
）
g
，雌雄各半，给药前禁食
16 h
，实验期间自由进食与饮水。按
30
、
60
、
120 mg/kg
的剂量单次
ig
给药，给药容积为
5 mL/kg
，每个剂量组
6
只。
iv
给药：健康
Wistar
大鼠
6
只，雌雄各半，体质量（
272
±
40
）
g
，给药前不禁食，试验期间自由进食与饮水。按
30 mg/kg
的剂量经尾
iv
，给药容积为
2 mL/kg
。
2.2.3
血浆样品的采集
单次
ig
给药：单次
ig
给药后
0.167
、
0.5
、
1
、
2
、
3
、
4
、
6
、
9
、
12
、
17
、
24
、
30 h
，分别自眼眶后静脉丛采血
200 µL
，肝素抗凝，
4
℃，
12 000 r/min
，离心
10 min
，分离血浆，分装于
EP
试管中，
−80
℃冷冻保存。
iv
给药：
iv
给药后
0.083
、
0.25
、
0.5
、
1
、
2
、
3
、
4
、
6
、
9
、
12
、
17
、
24
和
30 h
，分别自眼眶后静脉丛采血
200 µL
，肝素抗凝，
4
℃，
12 000 r/min
，离心
10 min
，分离血浆，分装于
EP
试管中，
−80
℃冷冻保存。
2.2.4
血浆样品处理与分析
精密吸取
50 µL
大鼠给药后的血浆样品，置于已加入
10 µL
乙酸工作液（
0.56 mol/L
）的玻璃管中，轻摇混匀，加入
25 µL β-
葡萄糖醛酸酶溶液（
100 U
），涡旋
30 s
混匀，置于
37
℃恒温水浴
1 h
；从水浴中取出后，加入内标柚皮素溶液（
2 µg/mL
，甲醇配制）
50 µL
，涡旋
30 s
混匀，再加入
2.5 mL
乙酸乙酯，涡旋
2 min
，
3000 r/min
离心
10 min
（
4
℃）；取上清液
2 mL
，
40
℃下氮气吹干，用
100 µL 50%
甲醇水溶液复溶，
12 000 r/min
离心
5 min
（
4
℃），上清进样
3 µL
，进行
LC-MS/MS
分析。
2.2.5
药动学参数计算
采用
WinNonlin 6.3
软件的非房室模型统计矩法计算药动学参数，其中血药浓度
-
时间曲线下面积（
AUC
0-
t
、
AUC
0-∞
）采用梯形法计算，消除半衰期（
t
1/2
）采用
Best Fit
法计算，
5 min
时药物浓度（
C
5min
）、峰浓度（
C
max
）、达峰时间（
T
max
）采用实测值。
2.3
组织分布研究
组织分布实验采用
ig
给药方式（与药效学实验一致），研究甘草苷的分布特征。
2.3.1
给药溶液的配制
精密称取甘草苷
300 mg
，加入
0.5%
羧甲基纤维素钠
25 mL
研匀至混悬，临用现配，即得质量浓度为
12 mg/mL
的
ig
药液。
2.3.2
动物给药
健康
Wistar
大鼠
18
只，雌雄各半，体质量
180
～
238 g
。进行
3
个时间点（
2
、
6
、
17 h
）的组织分布实验，每个时间点
6
只，雌雄各半。给药前大鼠禁食
16 h
，给药后
4 h
进食，实验期间自由饮水。按
60 mg/kg
的剂量
ig
给药，给药容积为
5 mL/kg
。
2.3.3
生物样品的采集
分别于给药后
2
、
6
、
17 h
乙醚吸入麻醉手术剪断颈动脉取血至肝素化试管中，于
10 min
内置于离心机中离心（
4
℃、
3000 r/min
，离心
5 min
），分装于
EP
试管中，
−80
℃冷冻保存；取血后乙醚过量麻醉脱颈处死动物，分别剖取脑、肌肉、脂肪、睾丸、卵巢、子宫、肝、脾、肾、肺、心、胃、小肠，纯水冲洗，滤纸吸干水分，称定质量，剪刀剪碎，放入
EP
试管中。将
EP
试管置于全自动匀浆机中，按照
5 mL/g
对应体积加入纯水进行匀浆，将各组织匀浆置于
−80
℃冷冻保存，待测。
2.3.4
组织样品处理与分析
除脏器组织样品以大鼠各组织匀浆代替血浆外，其他实验操作同
“
2.2.4
”
项
。上述处理过程用于组织样品中总甘草素浓度的测定。应用于游离甘草素的浓度测定时，不加入乙酸工作液和
β-
葡萄糖醛酸酶进行孵育，其余处理过程与总甘草素的浓度测定一致。
2.3.5
数据处理
（
1
）
组织含量计算
：由
LC-MS/MS
法测定并经
Analyst1.5.2
数据处理软件计算获得的各组织样品的质量浓度单位为
ng/mL
，换算成各组织含量（
ng/g
）需乘以匀浆体积与各组织质量的比值（
5 mL/g
），具体公式如下。
组织含量＝组织匀浆测定浓度×
5
（
2
）
组织暴露量计算
：采用梯形法计算总甘草素和游离甘草素在各组织中的
AUC
0-17 h
，以考察药物在各组织中的分布程度。
2.4
跨膜转运机制研究
2.4.1
无血清细胞培养基
-
多药耐药蛋白
1
（
MDCK-MDR1
）细胞模型的建立
Madin-Darby canine kidney
（
MDCK
）
-MDR1
细胞是将人类的
MDR1
基因转染到
MDCK
细胞上产生的
[14-15]
，多药耐药蛋白（
MDR1
）也称为
P-
糖蛋白（
P-gp
）
[16]
。
MDCK-MDR1
细胞广泛应用于
P-gp
底物和抑制剂的体外快速筛选研究。该细胞株由日本富士生物医药研究所友情赠送。细胞培养方法如下
[17]
：
MDCK-mock
和
MDCK-MDR1
细胞于常规培养皿内，以高糖
DMEM
培养液（含
10% FBS
）在
37
℃、
5% CO
2
的培养箱内培养，用含
0.25% EDTA
的胰酶消化，用新鲜培养液调细胞密度至
2
×
10
5
/mL
接种于
Transwell
聚碳酸酯膜
12
孔板中（膜面积为
1.13 cm
2
）。在顶端侧（
AP
）每孔加
0.5 mL
细胞悬液，基底侧（
BL
）每孔加
1.5 mL
新鲜培养基，每天换液，连续培养
6 d
，得到完全分化的细胞单层。
本实验所用
MDCK-mock
和
MDCK-MDR1
细胞均为
25
～
30
代。
2.4.2
MDCK-mock
和
MDCK-MDR1
单层细胞电阻（
TEER
）
测定
MDCK-mock
和
MDCK-MDR1
细胞接种于
Transwell
膜上培养
6 d
；将
Millcell ERS-2
电阻仪的电极放入含有
Hank's
平衡盐溶液（
HBSS
）的烧杯中，预平衡
20 min
；移去培养板中的培养液，
AP
侧每孔加预热的
HBSS 0.5 mL
，
BL
侧每孔加预热的
HBSS 1.5 mL
，
37
℃平衡
20 min
，洗去细胞表面的杂质；移走
HBSS
，重新加入预热的
HBSS
，测定跨膜电阻值；用
1
个空白载体重复上述步骤以获得空白值。
2.4.3
细胞单层的双向转运实验
[17]
（
1
）
AP→BL
方向的转运试验：吸去
Transwell
小室
AP
和
BL
端
的培养基，加入
37
℃预热的
HBSS
溶液，
37
℃平衡
20 min
；吸去
HBSS
，在
AP
端加入
0.5 mL
预热的含有甘草苷
/
甘草素的
HBSS
溶液，
BL
端加入
1.5 mL
空白
HBSS
溶液；
37
℃恒温振荡器培养
1.0 h
，振荡器转速为
80 r/min
；吸取
BL
端的转运液，测定转运液中的甘草苷
/
甘草素浓度。
（
2
）
BL→AP
方向的转运试验：吸去
Transwell
小室
AP
和
BL
端的培养基，加入
37
℃预热的
HBSS
溶液，
37
℃平衡
20 min
；吸去
HBSS
，在
AP
端加入
0.5 mL
空白
HBSS
溶液，
BL
端加入
1.5 mL
预热的含有甘草苷
/
甘草素的
HBSS
溶液；
37
℃恒温振荡器培养
1.0 h
，振荡器转速为
80 r/min
；吸取
AP
端的转运液，测定转运液中的甘草苷
/
甘草素浓度。
2.4.4
数据的处理与分析
（
1
）
TEER
的计算
：采用
TEER
值表征细胞间紧密连接的完整性，并按照公式计算。
TEER
＝
(
测定电阻值
－
空白值
)
×单层表面积
（
2
）
表观渗透系数（
P
app
）的计算
：采用
P
app
值的大小表征药物透过单层细胞的能力和药物吸收的速度以及程度。研究表明药物在
Caco-2
细胞模型的
P
app
与药物人体口服吸收程度相关性良好，且与药物在
MDCK
细胞和
Caco-2
细胞中的渗透性有良好相关性。
P
app
＝
d
Q
/d
t
×
1/
A
×
1/
C
0
d
Q
为药物在
d
t
时间内的透过量，
A
为膜的表面积，
C
0
为初始浓度。
（
3
）
外排率（
R
E
）的计算
R
E
值的大小反映药物外排的能力，通过
R
E
值可以推测药物是否为
P-
糖蛋白的底物。当待测药物的
R
E
≥
2
时，表明药物可能为肠道外排转运体的底物，当
R
E
≤
0.5
时，表示该药物可能为肠道摄入型转运蛋白的底物，需要做进一步研究。
R
E
＝
P
app
(BL
－
AP)/
P
app
(AP
－
BL)
3
结果
3.1
吸收动力学
3.1.1
大鼠单次
ig
给药的血浆总甘草素浓度
-
时间
曲线
大鼠
ig
给药后，
3
个剂量组动物不同时间平均血浆总甘草素浓度
-
时间曲线比较见图
1
。
3.1.2
大鼠
iv
给药的血浆总甘草素浓度
-
时间数据
在
30 mg/kg
剂量下大鼠
ig
与
iv
给予甘草苷后，不同时间相应的平均血浆总甘草素浓度
-
时间曲线比较见图
2
。
3.1.3
大鼠单次
ig
、
iv
后血浆总甘草素药动学参数比较
大鼠单次
ig
、
iv
后血浆总甘草素药动学参数见表
1
。在大鼠单次
ig
甘草苷后，在
30
～
120 mg/kg
剂量内，与体内暴露量密切相关的药动学参数
AUC
0-30 h
、
AUC
0-∞
、
C
max
随剂量增加而增加，增加的比例小于剂量比；与分布、消除过程密切相关的
t
1/2
、清除率（
CL
）、分布表观容积（
V
d
）等参数与给药剂量不相关，不随给药剂量增加而呈明显变化。上述情况均表明大鼠单次
ig
甘草苷后，在
30
～
120 mg/kg
剂量内不呈线性动力学特征。根据大鼠
ig
给予甘草苷后总甘草素的
AUC
0-30 h
均值与同剂量下
iv
给予甘草苷后总甘草素的
AUC
0-30 h
均值进行计算，大鼠
ig
甘草苷后的绝对生物利用度为
80.6%
。
3.2
组织分布研究
3.2.1
甘草苷的组织分布特点
大鼠
ig 60 mg/kg
甘草苷后在
2
、
6
、
17 h
这
3
个时间点平均总甘草素和游离甘草素在各组织
/
血浆的分布见表
2
。对各组织
/
血浆中总甘草素和游离甘草素含量进行分析比较，结果表明：（
1
）大鼠
ig
给予甘草苷后，血浆中
2 h
和
