今天给大家分享两篇项目文章，第一篇文章用代谢组+转录组技术解析丹参花花青素调控网络，迈维代谢提供了广泛靶向代谢组检测分析和转录组测序分析、以及两个组学联合分析相关的内容。第二篇文章研究了miR156在杨树花青素生物合成中的调控作用。迈维代谢提供了广泛靶向代谢组检测及分析相关的内容。
期刊：BMC Plant Biology
发表时间：2020.07
单位：河北省农林科学院经济作物研究所
2020年7月，河北省农林科学院经济作物研究所姜涛和刘灵娣老师在BMC Plant Biology上发表了名为“Integrated metabolomic and transcriptomic analysis of the anthocyanin regulatory networks in Salvia miltiorrhiza Bge. flowers”的论文。由迈维代谢提供了广泛靶向代谢组检测分析和转录组测序分析、以及两个组学联合分析相关的内容。
花青素是一类重要的天然色素，广泛分布于叶、花、果、根中，属于黄酮类代谢物。目前已鉴定出超过635种花青素。矢车菊色素( Cy) 、飞燕草色素( Dp) 、天竺葵色素( Pg) 、芍药色素( Pn) 、牵牛花色素( Pt) 和锦葵色素( Mv)，是六种常见的花青素，是紫色、蓝色和红色的来源。花青素的生物合成是由苯丙素和类黄酮生物合成途径中的一系列酶催化的，酶和转录因子编码基因的表达在调控花青素生物合成中发挥着多种关键作用。本研究利用代谢组学和转录组学，通过鉴定不同的花青素代谢物，并分析涉及花青素生物合成的差异表达基因(DEGs)，研究了丹参花中花青素生物合成的调控网络，为丹参花花青素生物合成的代谢工程提供了候选基因。
样本：丹参白花(WFSM)和丹参紫花(PFSM)。三个生物学重复。
1.丹参花中总黄酮和花青素的测定：分光光度计- WFSM中总黄酮含量高于PFSM，而花青素含量低于PFSM
对丹参花中总黄酮和花青素的含量进行测定，结果表明，WFSM中总黄酮含量约为5.83 mg/g，高于PFSM中的5.05 mg/g。WFSM相对花青素含量为2.72 units /g，显著低于PFSM的9.93 units /g(图1)。
2. 代谢组分析：UPLC/ESI-Q TRAP-MS/MS -矢车菊素双葡糖苷、锦葵色素双葡萄糖苷、矢车菊素半乳糖苷可能是丹参花呈紫色的主要成分
共鉴定出84种不同的黄酮类代谢物，分为8类，其中黄酮36种，黄酮醇27种，花青素11种，异黄酮3种，黄烷醇2种，二氢黄酮醇2种，二氢黄酮2种，查尔酮1种(图2)。大部分类黄酮的骨架包括芹菜素，槲皮素，山奈酚；大部分类黄酮为O-糖苷类，只有少数为C-糖苷类；异鼠李素、木犀草素、异槲皮素、槲皮素、金丝桃素、芹菜素、山奈酚及其糖苷含量丰富。以|Log2FC|≥1和VIP≥1为标准，在WFSM vs. PFSM中筛选到18个(占总含量的21.4%)显著差异的类黄酮，12种上调，6种下调。其中，槲皮素-3-O-葡萄糖苷、金丝桃苷、橙皮素 5-O-葡萄糖甙、异槲皮苷、橙皮素 5-O-葡萄糖甙、5,6-二羟基-7,4'-二丹参花中共鉴定出甲氧基黄酮的含量在WFSM中比在PFSM中显著上调(2.48 ~ 3.11倍)。
鉴定到的11种花青素包括矢车菊色素，牵牛花色素，芍药色素，天竺葵色素，飞燕草色素和锦葵色素。其中，矢车菊素双葡糖苷、锦葵色素双葡萄糖苷、矢车菊素半乳糖苷的含量在PFSM中比在WFSM中分别显著升高620.16倍、42.67倍、2.04倍，可能是丹参花呈紫色的主要成分。
图3. PFSM和WFSM中黄酮类和花青素代谢物的相对含量
3. 转录组分析：Illumina HiSeq™ 2500-30个糖基转移酶基因，25个甲基转移酶基因，1个酰基转移酶基因催化了不同类型的类黄酮和花青素的合成
共获得48.95M clean reads，共注释了28539个unigenes。按照标准|Log2FC|≥1,FDR < 0.05，在WFSM vs. PFSM中鉴定到1994个差异表达基因(DEGs)，包括1173个上调基因和821个下调基因 (图4a)。GO富集分析在生物过程大类中注释到19个花青素条目、33个类黄酮条目(图4b)。KEGG富集分析显示，DEGs在包括类黄酮和花青素生物合成途径在内的许多代谢过程中富集(图5a)。1994个DEGs中，发现30个糖基转移酶基因，25个甲基转移酶基因，1个酰基转移酶基因催化了不同类型的类黄酮和花青素的合成；检测到6个GST基因、12个ABC转运基因、9个MATE基因和7个SNARE基因，这些基因可能在花青素转运到植物液泡中发挥重要作用(图5b)。
4. 联合分析：KEGG共注释-有21个编码类黄酮和花青素生物合成途径中关键酶的unigenes存在差异表达，除2个ANS基因下调外，其它都上调
研究编码类黄酮和花青素生物合成途径中10个酶的100个unigenes 发现，有21个关键unigenes存在差异表达，19个上调和2个下调。除2个ANS基因（SMil_00006040和SMil_00029434，下调了1.304- 4.631倍）外，白色花中其它基因的表达量均高于紫色花，包括7个CHS、1个CHI、3个F3H、1个F3’H、1个F3’5’H、1个FNS II、3个DFR和2个UAGT基因，表达上调了1.033- 3.13倍(Log2FC)。这些DEGs影响了丹参花中花青素的生物合成。
图6. 花青素在PFSM和WFSM中的生物合成途径
NCBI Blast分析表明SMil_00029434蛋白质序列和SmANS (S. miltiorrhiza，AWX67417.1)有99.41%的一致性,而SMil_00006040蛋白序列分别与SiANS(Sesamum indicum，XP_020551541.1), OeANS (Olea europaea var. sylvestris，XP_022887681.1), DhANS (Dorcoceras hygrometricum，KZV49046.1), and CaSnRK1 (Coffea arabica，XP_027087242.1)有81.19，71.01，69.3，68.59%的一致性。系统进化分析显示，SMil_00006040 蛋白与芝麻和樟子松木樨榄的ANS 蛋白关系相近。SMil_00006040基因的序列在NCBI数据库中没有报道。我们认为SMil_00006040基因是丹参中一种新的ANS基因。
筛选到与花青素生物合成相关的90个差异表达的转录因子，其中有14个被注释为MYB相关基因，包括MYB36、MYB44、MYB113等。另外还发现了编码bHLH的9个基因、1个编码WD40的基因等。这些转录因子可能参与了丹参花中花青素的生物合成。
5. QRT-PCR-荧光定量：qRT-PCR结果与RNA-Seq的结果一致
选择了12个DEGs来验证转录组测序结果。qRT-PCR结果显示，WFSM中有11个基因表达量高于PFSM, 1个基因表达量低于PFSM。qRT-PCR结果与RNA-Seq的结果一致。
研究目的：通过代谢组学和转录组学的方法揭示丹参白花和紫花的花青素合成代谢途径。
研究结果：在丹参白色和紫色花之间共鉴定出1994个差异表达基因和84个黄酮类差异代谢物。矢车菊素-3,5-O-双葡萄糖苷、锦葵花素双葡萄糖苷和矢车菊素-3-O-半乳糖苷可能是导致丹参花呈紫色的主要原因。有21个编码类黄酮和花青素生物合成途径中关键酶的unigenes存在差异表达，参与了丹参花的花青素生物合成。
MiR156通过SPL靶点和其他microRNA调控杨树花青素的生物合成
期刊：Horticulture Research
发表时间：2020.08
单位：中国科学院青岛生物能源与过程研究所
2020年8月，中国科学院青岛生物能源与过程研究所付春祥老师团队在Horticulture Research上发表了名为“MiR156 regulates anthocyanin biosynthesis through SPL targets and other microRNAs in poplar”的论文。由迈维代谢提供了广泛靶向代谢组检测及分析相关的内容。
MicroRNAs是一类内源性非编码小RNA，在植物和动物中负调控基因表达，已经被证明在植物花青素的生物合成中发挥重要作用。与草本植物和块茎植物相比，对于杨树这一重要的木本植物物种中涉及花青素生物合成的结构基因、转录因子和microRNA的研究还比较匮乏。此外，miR156过表达对其他与花青素积累相关的microRNAs的影响尚未被研究。本研究整合small RNA测序、转录组和代谢组学，揭示了miR156过表达对其他microRNA及其与花青素生物合成相关的靶点的综合影响，为园艺、生物能源和造纸等领域的新型杨树种质的生物工程和后续育种提供了新的潜在目标。
样本：miR156过表达杨树株系和野生型杨树株系10月龄植株顶部的幼茎。三个生物学重复。
1.形态特征分析：miR156过表达改变了杨树的形态，且改变程度与表达量相关
根据pre-miR156b的表达水平，将转基因杨树株系分为两组：Ⅰ组和Ⅱ组(图2a)。第Ⅰ组转基因杨树株系分枝数适度增加，叶片大小略有减小，株高正常(图1a, b)。第Ⅱ组转基因杨树株系分枝数大量增加，呈矮秆型；叶片大小严重缩小；腋芽增多；茎、叶缘和叶柄的表皮呈红色(图1a, c-j)。pre-miR156b的水平大致解释了转基因杨树植株的形态(图1和图2)。进一步检测成熟miR156及其SPL靶点在转基因杨树植株中的表达水平发现，与野生型相比，转基因株系中成熟miR156等的表达水平提高了20 ~ 305.3倍(图2b)， mir156靶点SPL-15、-17和-24的表达水平在转基因植株中也相应下降(图2c, d)。综合来看，外源miR156b在杨树形态变化过程中发挥了剂量依赖的有效作用。
2.Small RNA测序：Illumina HiSeq 2000/2500- miR156过表达改变了杨树中其它microRNA的水平
为了研究miR156过表达对杨树其它microRNA水平的影响，构建了野生型和II组转基因杨树(TGII-1、-2、-3)的small RNA文库。两个small RNA文库各产生60,375,019和60,210,670个原始reads。去除低质量、含接头的序列、mRNA和Pfam RNA 序列后，将碱基长度在18 - 25 nt之间的reads进一步作为典型的microRNA进行分析。维恩图分析显示，462个microRNA在两个文库中都表达(图3a)，80个microRNA在野生型中特异性表达，78个microRNA在转基因植株中特异性表达(图3a)。两个文库中检测到的microRNA具有相似的长度和碱基偏好，长度多为21 nt和24 nt (图3b)。分析核苷酸序列发现，两个文库中尿苷(U)是5 '端最常见的核苷酸。将测序得到的microRNA序列与miRBase数据库中收录的microRNA序列进行比对，从两个small RNA文库中共检索到78个保守的microRNA。最保守的microRNA（包括miR156、miR159、miR160、miR164、miR166、miR167、miR171、miR172、miR390、miR408和miR482）在野生型和转基因杨树中均大量表达。此外，从野生型和转基因杨树植株中鉴定出144个非保守microRNA。在野生型和/或转基因杨树的文库中首次发现了6种数量在10个以上的成熟microRNAs(图3c)。
图3. 野生型和II组转基因杨树植株的microRNA组学分析
注：A. 野生型和II组转基因杨树中鉴定出的microRNA数量的维恩图。B. 野生型和II组转基因杨树中microRNA的长度分布。C. 预测了从野生型和II组转基因杨树中鉴定的6个新的microRNAs的折叠结构。蓝色标记为成熟的microRNA序列，红色标记为microRNA*序列。D. 野生型与II组转基因杨树差异表达microRNAs的数量。WT表示野生型，miR156OE为二组转基因杨树，包括TGII-1、-2、-3。
采用标准|log2 (fold change)|≥1,p值≤0.05筛选野生型和转基因杨树的差异表达microRNAs (DEMs)，共得到228个DEM，其中miR164、miR167、miR169、miR396、miR472、miR858、PC3p-2758_1045、PC-5p-178251_28等96个microRNAs在转基因杨树植株中表达上调(图3c, d)，132个microRNA（miR159、miR171和miR172等）表达下调(图3c, d)。
4.转录组分析：Illumina HiSeq 4000-在杨树中过表达miR156对其下游基因有整体影响
为了研究miR156过表达对下游基因的影响，检测了野生型和II组转基因杨树的转录组。与野生型相比，转基因杨树中有3284个基因上调， 3601个基因下调(图4a)。联合microRNA组和转录组分析，确定了116个差异表达基因(DEGs)为85个DEMs的靶标。对DEGs进行KEGG通路分析，3105个DEGs(占6885个DEGs的45.10%)被注释到137个KEGG通路，多数富集通路与植物病原相互作用、核糖体、植物激素信号转导、光合作用、以及黄酮，黄酮醇，类黄酮和玉米素的生物合成有关(图4b)。
之前的研究表明，mir156靶向的AtSPL9/15可以调控拟南芥花青素的生物合成。从杨树84K品种RNAseq数据集中检索到的mir156靶向的SPL8、SPL11、SPL12、SPL17、SPL28和SPL29（都是AtSPL9/15的同源基因）转录丰度在转基因杨树中显著降低。qRT-PCR分析也一致显示，所有这些mir156靶向的SPLs在转基因杨树植株中都下调。为了进一步研究转基因杨树中大量花青素的分子机制，我们分析了野生型和II类转基因杨树中黄酮类生物合成途径中关键酶和转录因子编码基因的表达水平。qRT-PCR分析显示，大部分花青素生物合成相关基因在转基因杨树植株中的表达水平均有所提高。特别是LDOX、UFGT和GST的转录丰度分别增加了15.1、6.4和5.1倍(图4c)。与野生型相比，转基因植株中PAL和DFR的表达水平分别提高了6.7倍和9.2倍(图4c)。
图4. 野生型和第二类杨树转基因植物的转录分析
除了miR156-SPL模块，还鉴定了两个microRNA靶点miR160h-ARF18和miR858-MYB39，它们具有调节杨树花青素生物合成的潜力。与野生型相比，转基因杨树株系中这两种microRNAs的水平显著提高(图5 a、b)，但它们的靶标 (ARF18和MYB39) 的表达下调(图5 a、b)。此外，WRKY11（AtWRKY57同源基因，与IAA29相互作用的生长素信号通路的激活剂）的表达水平在转基因杨树植株中发生了变化。随后测定了野生型和II组转基因杨树中MBW复合体组分(如TT2、TT8和TTG1)的转录丰度，只有WER(TT2-type MYB转录因子）水平在转基因植株中出现了显著变化。此外，我们还研究了miR156水平对野生型和转基因杨树植株中miR160h和miR858积累的影响，发现miR160h和miR858的积累与miR156水平呈强正相关(图5c, d)。
图5. 过表达miR156影响了野生型和II组转基因杨树中miR160h、miR858及其靶基因的表达水平
5. 代谢组分析：UPLC-MS/MS-miR156转基因杨树中花青素、黄酮和黄酮醇的含量显著提高，而木质素的总含量降低
与野生型相比，转基因杨树的总花青素含量增加了8.3倍。之前的研究表明，miR156在柳枝稷中过表达可以减少木质素的积累。此外，在木质素基因（ CCR1、F5H和COMT）的启动子区域发现了与mir156靶向SPLs结合所需的GTAC基序。测量野生型和转基因杨树中木质素的总含量，发现与野生型相比，转基因杨树中的AcBr木质素水平显著降低(图6)。代谢组学分析筛选到228个差异累积代谢物(DAMs)，其中96个上调， 132个下调。KEGG分析显示：花青素，异黄酮，类黄酮，黄酮、黄酮醇和苯丙素生物合成途径所涉及的代谢物积累差异较大。花青素（包括矢车菊素-3-O-葡萄糖苷, 矢车菊素-3-O-芸香糖苷和天竺葵素-3-O-葡萄糖苷）在转基因植株中的含量显著高于野生型杨树(图6)。此外,转基因杨树的黄酮和黄酮醇含量显著增加，而木质素衍生酚类物质含量下降(图6)。
图6. 在野生型和II类转基因杨树中苯丙素途径代谢物的相对丰度
研究目的：研究miR156在杨树花青素生物合成中的调控作用。
研究结果：
1. Small RNA测序分析筛选到228个在miR156转基因杨树植株中差异表达得microRNA，说明miR156过表达改变了杨树中其它microRNA的水平；
2. microRNA组和转录组联合分析发现miR160h和miR858具有调节杨树花青素生物合成的潜力，其积累与miR156水平呈正相关；
3. 代谢组学分析发现过表达miR156的转基因杨树中花青素、黄酮和黄酮醇的含量显著提高，而木质素的总含量降低。
综上所述，miR156可以通过多种因素(包括microRNAs、转录因子和结构基因水平)对杨树的花青素生物合成途径进行微调。
