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人成纤维细胞衍生的基质水凝胶通过与巨噬细胞的相互作用加速伤口再生

BCML速递 · 公众号 · · 2024-09-07 22:29

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皮肤是保护我们免受病原体和各种外界刺激侵害的最前线防线。皮肤损伤会导致水分和电解质的流失、继发感染和多种并发症。伤口修复是一个非常复杂的过程，涉及许多不同的参与者，包括免疫细胞、生长因子、细胞因子、邻近细胞和细胞外基质（ ECM ）。因此，深入了解这种动态的相互作用是解决伤口完全愈合的关键。免疫细胞在组织再生中的作用大部分仍然是未知的，而且常被低估。巨噬细胞是一种先天免疫细胞，其表型极具可塑性，在启动、调节和完成伤口愈合过程中起着至关重要的作用。 ECM 在组织再生中也起着非常重要的作用， ECM 会与细胞相互作用，从而调节细胞功能，包括巨噬细胞。从动物器官或组织中获得的脱细胞 ECM （ dECM ）已被广泛应用到再生医学领域。基于此，来自韩国科学技术研究院的 Kwideok Park 教授团队提出了一种新型水凝胶，即成纤维细胞衍生的基质水凝胶（ FDM 凝胶），它使用从体外培养的人成纤维细胞中获得的去细胞 ECM （ cdECM ）制成。这种 FDM 凝胶物理上稳定、具有粘弹性，并且含水量极高，可有效调节免疫反应，从而实现基质的再生与重塑和伤口愈合。

为了制备 FDM 凝胶，研究人员将人类成纤维细胞培养在培养塑料上，然后进行轻度脱细胞，收集 cdECM （图 1A ）。这些过程可实现 ECM 成分的包裹及 ECM 分子的物理结合，引发蛋白质间互作，最终生成纯 ECM 水凝胶，即 FDM 凝胶（图 1B ）。相差图像显示 FDM 凝胶中存在相互连接的纤维基质（图 1C ），因具有亲水性而含水量高（图 1D ），表面呈现纤维网状网络（图 1E ）。 FDM 凝胶物理稳定性优异，在 37°C 的 PBS 溶液中可保持其原始形状长达 14 天，且几乎不膨胀（图 1H ）。该 FDM 水凝胶具有粘弹性，存储（ G′ ）和损耗模量（ G″ ）是胶原水凝胶的一半（图 1I ）。 FDM 水凝胶在组织再生方面的另一大优势是保留了大量生物活性分子。血管生成相关细胞因子阵列揭示了 FDM 水凝胶中含有多种生物活性分子，例如 bFGF 、 FGF-7 、肝细胞生长因子（ HGF ）等（图 1J ）；蛋白质组学分析发现 FDM 水凝胶包含许多参与细胞功能的 ECM 蛋白（图 1K ）； GO 分析表明 FDM 凝胶对于伤口愈合相关的生物过程，胶原纤维组织、血管生成和细胞粘附等生物过程有显著促进作用（图 1L ）。

研究者发现，宿主细胞可在 FDM 凝胶主动渗透。他们分别在小鼠皮下植入 FDM 凝胶和 Col 凝胶，可见 FDM 凝胶周围高度血管化（图 2B ）。 H&E 染色后，可见 FDM 凝胶内有许多细胞，表明宿主细胞有活跃的细胞浸润（图 2C ），而 Col 凝胶中的细胞很少（图 2D ）。此外，对移植物周围纤维屏障的评估显示， FDM 凝胶的纤维层比 Col 凝胶的纤维层薄（图 2G ）。 FDM 凝胶中 TNF-α 浓度一直维持在较低水平（图 2H ），髓过氧化物酶（ MPO ）活性随时长而明显降低（图 2I ）。通过免疫荧光研究者观察到 FDM 凝胶内部有 CD11b ⁺ /F4/80 ⁺ 细胞，证明有免疫细胞浸润，是促组织再生的早期信号（图 2J ）。

随后，研究者通过小鼠的全层皮肤伤口模型研究了 FDM 凝胶的治疗效果，使用 Tegaderm 敷料作为对照。结果显示， FDM 凝胶可使伤口闭合速度加快（图 3A ）。第 7 天时， FDM 凝胶处理的伤口中再生真皮较厚，并在 14 天时发现真皮层中有许多毛囊（图 3C ， 3J ），成熟胶原蛋白沉积明显（图 3D 、 K ）。通过共免疫染色，研究者发现在早期（ 7 天） FDM 凝胶的肌成纤维细胞丰富（图 3E ），但这种趋势在第 14 天发生了逆转，肌成纤维细胞在敷料治疗组大量出现，而 FDM 凝胶组的肌成纤维细胞大量减少，这表明 FDM 凝胶处理的伤口以时间依赖性的方式遵循正确的伤口修复路径。研究者还观察到， FDM 凝胶组的新血管形成水平明显更高（图 3L ），表皮层发育更良好（图 3G ），表明 FDM 凝胶促再生性能优异。

皮肤附属物（即毛囊、腺体）的完全恢复是伤口再生的关键步骤。研究中为了彻底研究毛囊新生机制，通过使用各种毛囊相关标志物（ α 平滑肌肌动蛋白（ α‐SMA ）、 β‐catenin 、 K10 、 CD34 、 K14 和 AE15 ）对伤口组织样本进行共免疫荧光染色来评估。在 FDM 凝胶的真皮中可以清楚地观察到新生的毛囊发育和显著上调的 β‐catenin 信号（图 4B ）。当用敷料处理伤口时，表皮中 K10 信号强烈，但真皮中 CD34 （ + ）细胞很少（图 4D ）；而 FDM 凝胶处理的伤口 CD34 广泛大量分布（图 4E ）。对于正常皮肤组织， K10 仅存在于正常表皮层中，而 CD34 （ + ）细胞主要存在于真皮中（图 4L ）。通过真皮中毛囊标志物表达的差异来识别成熟的毛囊，研究者发现在敷料组中没有发现任何成熟的毛囊，在 FDM 凝胶处理的伤口中发现了一些，但不及正常真皮中的数量（图 4G-I ）。 FDM 凝胶对细胞增殖同样十分有效， FDM 凝胶上的人真皮乳头细胞（ HDPC ）在第 3 天显示出显著的 β-catenin 活化水平（图 4M 、 N ）。此外，巨噬细胞来源的条件培养基（ FDM-Mac-CM ）有效提高了 FDM 凝胶中 HDPC 的 Akt 磷酸化（图 4O 、 P ）及 bFGF 表达（图 4Q ），表明巨噬细胞介导的旁分泌因子可以刺激 Akt 信号通路，从而部分促进毛囊形成。

研究者发现 FDM 凝胶在伤口区域贴合时具有粘性（图 5A ）。 FDM 凝胶处理的伤口组织染色显示纤连蛋白阳性（图 5B ），其中可能包括 α‐SMA （ + ）肌成纤维细胞（红色），这表明除免疫细胞外还有其他细胞浸润，从而与肌成纤维细胞相互作用（图 5C ）。伤口组织在不同时间点的蛋白质印迹结果表明，在早期时间点，波形蛋白（ + ）和 α‐SMA （ + ）细胞的细胞活性增强，但在后期迅速减弱（图 5D 、 E ）。肌成纤维细胞在伤口中存在的时间过长会导致疤痕形成。这表明， FDM 凝胶以时间依赖的方式积极调节肌成纤维细胞行为以促伤口愈合。与敷料组相比， FDM 凝胶处理组再生伤口组织中肿瘤坏死因子 α （ TNF-α ）水平显著降低（图 5L ）；第 7 天巨噬细胞百分比（ CD11b ⁺ /F4/80 ⁺ ）和 M2 样表型（ CD11b ⁺ /F4/80 ⁺ /CD206 ⁺ ）显著升高（图 5I 、 J ），然后在第 10 天降低（图 5K 、 M ）。这种时间依赖性的巨噬细胞极化还与生长因子的分泌有关，例如 VEGF 和 bFGF 。研究者发现 FDM 凝胶处理的伤口在早期时间点的 VEGF 和 bFGF 水平明显较高（图 5N 、 O ）。生长因子之间的相互作用很复杂，很难准确解释其工作机制，但 FDM 凝胶可能促进免疫调节、再生环境，在伤口愈合级联过程中启动和促进细胞的愈合活动。

巨噬细胞与 FDM 通过特定细胞表面整合素之间的相互作用对于伤口成功愈合至关重要。因此，研究者体外重现了 FDM- 巨噬细胞相互作用，以深入研究细胞反应。 THP-1 衍生的巨噬细胞对组织培养板（ TCP ）和 FDM 底物均表现出良好的附着力， FDM 上的巨噬细胞表达 M2 标记物，而 TCP 上几乎没有观察到这种标记物（图 6A ）。 FDM 凝胶中促炎标志物 iNOS 的下调和抗炎信号的上调进一步证实了这一点（图 6B 、 C ）。然而，与 TCP 相比，在 FDM 上培养巨噬细胞时， VEGF 和 bFGF 水平显著增加（图 6E 、 F ），这对促进伤口愈合具有重要意义。 Akt 磷酸化增加与各种细胞活动有关，包括生长因子的产生，因此推测增强的生长因子分泌可能是通过特定细胞表面整合素与巨噬细胞 -FDM 相互作用的结果（图 6L ）。为了证明该假设，研究者使用特异性整合素阻断剂 ATN 161 和 obtustatin 处理巨噬细胞，分别阻断整合素 α5β1 和整合素 α1β1 。结果显示 VEGF 的释放仅受 obtustatin 影响， VEGF 水平显著降低（图 6N ）。 ATN 161 反而刺激了 VEGF 的分泌。然而，与未治疗组相比， ATN 161 和 obtustatin 都大大减少 bFGF 的分泌（图 6O ）。细胞与 ECM 之间通过整合素相互作用，进而激活 Akt 信号通路，随后产生生长因子。在该研究中， p‐Akt 水平在 α5β1 阻断后显着下调（图 6P ）。巨噬细胞与 FDM 的相互作用显著促进 MMP-9 活性（图 6J 、 K ），但整合素 α1β1 被阻断 1 天后， MMP-9 表达量显著减少，但整合素 α5β1 的阻断对 MMP-9 影响不大（图 6Q ）；阻断整合素 α1β1 和 α5β1 3 天后， MMP-9 活性受到严重抑制（图 6R ）。以上结果表明， FDM 凝胶通过免疫细胞介导的 MMP 进行生物降解也非常关键，这会导致基质重塑，以促进伤口组织再生。

为了验证巨噬细胞的作用，研究者利用氯膦酸盐脂质体制备了小鼠巨噬细胞耗竭模型。结果显示，耗竭组剩余伤口面积明显大于非耗竭组（图 7D ）。非耗竭组的伤口恢复情况明显好于耗竭组（图 7E 、 F ）。此外，平均新生血管面积在耗竭组和非耗竭组之间显示出巨大差异（图 7G 、 H ）。耗竭模型中生长因子 VEGF 和 bFGF 明显减少（图 7I 、 J ），且具有大量的 α‐SMA （ + ）细胞（图 7N ）。肌成纤维细胞的这种持续存在可能与缺乏 FDM- 巨噬细胞相互作用有关， FDM 凝胶有助于调节成纤维细胞和肌成纤维细胞的平衡。

综上所述， FDM 凝胶表现出优异的伤口愈合能力。一方面， FDM 凝胶可促进免疫细胞募集，在体内进行免疫调节，抑制促炎细胞因子的释放并促进促愈合生长因子的产生；另一方面， FDM 凝胶与巨噬细胞的细胞表面整合素密切相互作用，这种相互作用不仅诱导 M2 样巨噬细胞极化，还刺激巨噬细胞释放 VEGF 和 bFGF 。这一发现为皮肤伤口愈合的治疗提供了新见解。

本研究由韩国科学技术研究院的 Kwideok Park 教授团队完成，并于 2024 年 5 月发表于 Advanced Science 。

论文信息： Savitri C, Ha SS, Kwon JW, Kim SH, Kim YM, Park HM, Kwon H, Ji MJ, Park K*. Human Fibroblast-Derived Matrix Hydrogel Accelerates Regenerative Wound Remodeling Through the Interactions with Macrophages. Adv Sci 2024, 11: e2305852.

供稿：季威

编辑：于启帆

审校：袁章琴