广东工业大学杨志峰院士、张偲院士团队Bioresource Technol.：探索深海环境中甲烷氧化生物的最佳培养条件和特性

成果简介

甲烷厌氧氧化古菌（ANME）在深海甲烷厌氧氧化过程中扮演重要角色，在海洋甲烷收支过程中起着重要作用。本研究通过自主研制的便携式高压培养组件进行长周期深海压力环境条件下的ANME富集培养 以确定其最佳的培养环境条件。结果表明，在10.5 MPa下样品中甲基辅酶M还原酶（ mcrA ）基因拷贝数最多（1.1×10 ⁶ copies/g），在4℃下样品中 mcrA 基因拷贝数最多（1.6×1 0 ⁶ copies/g）。ANME-2c在4℃条件下的最佳富集压力为10.5 MPa， ANME-2c的最佳后续孵育时间不超过211天。并且最近分类群指数与孵育时间呈显著相关（ P < 0.05），总无机碳和硫酸根离子是驱动群落构建的关键环境因子。这项研究为ANME-2c的富集以及微生物在富集过程中如何在共同栖息地共存提供了新的见解。

随着 21 世纪初期持续性全球变暖的证据越来越多，人们对甲烷引起温室效应的重要性有了更深入的认识。在海洋环境中，厌氧甲烷氧化过程每年消耗多达 300 Tg 的甲烷，从而防止甲烷从沉积物中逸出，对全球温室气体变化产生严重影响。其中， ANME 等功能性群落在平衡海底甲烷方面发挥着关键作用。如何有效培养这些微生物群落是理解其功能和机制的关键途径 。

ANME-2 是冷泉中占主导地位的甲烷厌氧氧化分支，温度范围为 4 至 14 ° C ，其繁殖周期为 2 至 7 个月，了解这一过程的机制一直是个挑战。 ANME 需要严格的厌氧条件和高浓度的甲烷。尽管目前还不清楚 ANME-2c 的生长和分布受哪些因素影响，但由于海水中硫酸根离子含量丰富，温度和压力更有可能是主要限制因素。此外，人们普遍认为，群落组合既受确定性因素的影响，也受随机因素的影响。但目前， ANME 群落在富集过程中的群落构建机制尚不清楚，需要进一步研究 。

因此，本研究通过模拟实验来探讨这一过程。最终目标是 (1) 确定 ANME-2c 的最佳富集条件，包括压力、温度和培养时间； (2) 揭示了 ANME-2c 富集过程中群落组合模式的机制； (3) 确定影响群落的环境因子。最终为甲烷消耗的最佳环境条件提供技术支持，并为如何防止海底甲烷排放到大气中提供理论依据。

图文导读

1 、在不同压力下化学性质的变化

不同压力下的 SO ₄ ^2- 、 TOC 、 TIC 、 pH 、细胞数量和基因拷贝数如图 1 所示。在不同压力孵育下，所有反应釜内的 SO ₄ ^2- 浓度都有所降低， 7.0 、 10.5 和 14 MPa 下的平均反应速率基本相同，比 0.1 MPa 孵育时高 2.3 倍（图 1A ）。在所有压力下 TOC 的平均消耗速率基本相同。随着微生物对 SO ₄ ^2- 和 TOC 的消耗，反应釜内 TIC 逐渐增加，高压下的平均反应速率是 0.1 MPa 时的 1.7 倍。同时，该过程与反应釜内 pH 的变化有关， pH 呈现先升高后降低的趋势，基本保持在 8.0 左右（图 1D ）。与其他压力相比， 10.5 MPa 下样品中 mcrA 基因拷贝数最多。

图 1 不同压力条件下的地球化学性质、细胞数目及基因拷贝数。

2 、在不同温度下化学性质的变化

在不同压力的孵育实验中，我们发现 10.5 MPa 是 ANME-2c 最合适的孵育压力。我们将温度分别设置为 4 ℃、 15 ℃和 30 ℃，探讨温度的影响，孵育压力固定为 10.5 MPa 。在不同温度条件下，所有反应釜内的 SO ₄ ^2- 含量均呈下降趋势。 TOC 的平均消耗速率与 SO ₄ ^2- 相似。温度水平不影响 TIC 和 pH 的变化（图 2C ， 2D ）。对于孵育结束时的细胞数量， 4 ℃时 TCC 、 ICC 或 DCC 的数量高于其他温度。对于 mcrA 基因的拷贝数， 4 ℃时的样品明显高于其他温度 。

图 2 不同温度条件下的地球化学性质、细胞数目及基因拷贝数。

3 、在最佳压力和温度下高压生物反应器中微生物群落组成

随着培养时间的延长，微生物多样性呈现先减少后增加的趋势，在第 75 天达到最小值。 NMDS 分析显示了古菌群落随孵育时间的变化。通过 Veen 分析，微生物群落的特有 ASV 数量呈先减少后增加的趋势。在门水平， Halobacterota 是古细菌中最多的门，占检索到的总序列的 67.2% - 97.3% 。根据热图，主要属 ANME-2c 在孵育期间呈先增加后减少的趋势，孵育 150 天后恢复到原生丰度，在 75 天达到最大丰度。此外，在孵育结束时， ANME-3 的丰度显著增加 。

图 3 反应釜中微生物群落组成。

4 、不同孵育时间下微生物群落组合过程及物种共存模式