基因组编辑技术经历了第一代锌指核酸酶(zinc-finger nuclease，ZFNs)、第二代转录激活子样效应因子核酸酶 (tran-scription activator-like effector nuclease，TALENs) 的发展，以及当前应用最广泛、研究最深入的第三代规律性重复短回文序列簇(clustered regularly interspaced short palindromic repeat，CRISPR / Cas) 系统。CRISPR/Cas 系统可以在动物、植物、微生物基因组上实现定点敲除、单碱基替换和插入、小片段精准插入和缺失等多种功能。但目前最广泛使用的Cas9和Cas12a核酸酶的尺寸过大，以至于超过了很多载体的装载量而难以递送至细胞核。插入序列类似 Cas9 的 B蛋白(insertion sequences Cas9- like B，IscB)和转座子相关转座蛋白 B( transposon-associated transposase B，TnpB)等新型核酸酶，是 IS200 / IS605 转座子超家族的成员，分别是Cas9和Cas12的祖先，两者的大小均为约400个氨基酸，较小的体积使得它们在递送到动植物细胞核上有较大的优势，从而成为当前基因组编辑技术的研究热点之一。
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亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室、岭南现代农业科学与技术广东省实验室、华南农业大学生命科学学院
刘耀光院士和祝钦泷研究员团队
在
《基因组学与应用生物学》
期刊第42卷12期发表了题为“
基因组编辑工具的发展：从CRISPR/Cas9 到 TnpB
”的述评，对IscB 和 TnpB的系统进化关系、作用原理、最新研究进展进行综述，以期为进行相关研究的人员提供帮助。
从 DNA 双螺旋结构发现以来，科学家们一直期望对生物体内的基因组进行修改和操控。从早期的寡核苷酸、小分子或自剪接内含子对 DNA 序列进行位点特异性识别，到利用蛋白质识别核苷酸序列的原理开发了位点定向的锌指核酸酶(zinc-finger nuclease，ZFNs) 和转录激活子样效应因子核酸酶 (transcription activator-like effector nuclease, TALENs)。在认识生命的微观世界过程中，基于规律性重复短回文序列簇(clustered regularly interspaced short palindromic repeat，CRISPR) 及其相关蛋白( CRISPR- associated protein，Cas) 的基因组编辑系统也经过了长期的发展。自 2013 年张锋团队首次将 CRISPR /Cas 应用在真核细胞基因组编辑中，生物学领域经历了一场前所未有的革命。从此开启了基因组编辑飞速发展的十年。在第一个十年，基于 CRISPR / Cas 开发的基因组编辑系统实现了在动物、植物、微生物基因组中定点敲除、单个或多个碱基替换、小片段精准插入和缺失等目标，在靶向、编辑、调节、修改、标记生物体内的基因组位点方面取得了巨大的进展。
对基因组编辑现有方法和新基因组编辑工具的总结，将更好地为基因组编辑技术和产业服务，促进基因组编辑更进一步发展。基因组编辑高速发展的第二个十年，将在临床治疗、农业育种和食品生产等不同行业进行更广泛、更灵活的运用，并且在基因功能研究、基因组重编程、癌症以及其他遗传疾病的治疗方面持续发挥重要作用。
基因组编辑技术发展至今，主要经历了三代不同的技术发展。第一代 ZFNs 基因组编辑系统，由可以识别特定碱基序列的锌指蛋白和一个可切割双链DNA 的核酸内切酶 Fok I组成, 其中, 锌指蛋白可人工设计, 其中包含了对应识别多个不同的三个特异串联连续碱基序列的锌指结构；第二代 TALENs 基因组编辑系统，以Fok I核酸内切酶定向切割 DNA 双链, 以转录激活因子样效应因子(TALE)基序的组合排列形成的序列来识别单个碱基对；第三代CRISPR/Cas基因组编辑系统, 来源于细菌和古细菌对抗噬菌体外源 DNA 入侵的免疫应答反应，需要多个应答元件参与作用, 经过改造后成为目前简洁的基因组编辑系统。其中应用最广泛的是 CRISPR/Cas9系统，Cas9核酸内切酶能够识别靶位点的原间隔邻近基序序列(protospacer adjacent motif, PAM)，并在单导 RNA( single-guided RNA，sgRNA) 引导下与靶序列结合, 造成DNA 双链断裂(double-strand breaks, DSBs)。由于靶点设计与载体构建较简单、编辑效率高以及能够实现多靶点编辑等优点，CRISPR/Cas9编辑系统已成为在动植物和微生物上使用最广泛、研究最深入的基因组编辑工具。在此基础上, Cas9 还被进一步开发为 dCas9 ( dead Cas，无切割活性) 和 nCas9( nick Cas，单链缺刻) 等不同变体，用于转录激活/ 抑制、表观遗传修饰、碱基编辑以及引导编辑等多种类型的基因组编辑操作。
图 1 CRISPR / Cas9 介导的基因组编辑原理
CRISPR/Cas 基因组编辑工具也存在部分局限性，主要体现在PAM 序列固定导致的靶向范围的限制、效应因子的尺寸过大导致的难以递送以及靶向特异性导致的脱靶等方面的问题。因此，科学家们在不同的细菌和古细菌中寻找到不同类型有基因组编辑能力的蛋白，以开发出多种多样的编辑工具，打造全面灵活的基因组编辑工具包。按照系统进化关系和分类, CRISPR-Cas9 是一种Ⅱ类( Class Ⅱ) 中的Ⅱ型( Type Ⅱ) CRISPR-Cas 系统，被认为是从 IscB 蛋白进化而来；而转座子相关转座蛋白( transposon-associated transposase B, TnpB) 是一类来自 V 型的 CRISPR 系统, 被认为是 Cas12 蛋白的祖先。本文重点描述这两种编辑工具最新研究进展及优化方式，以及其相较于 Cas9 和 Cas12 的特点与区别，并对其今后的应用方向进行展望。
图 4 TnpB 与 Cas12f 蛋白结构域和 ωRNA 比较
现有的关于 IscB 和 TnpB 的相关研究较少，集中于系统进化地位、切割活性验证、ωRNA 元件必要性等方面， 并且应用该蛋白进行基因组编辑的直接范例较少。但是这两种蛋白在大小上较 Cas9 具有很强的优势，其编辑系统经过基于蛋白工程的优化后，较小的体积可以使病毒载体的递送更简单，对于基因组编辑治疗疾病和动植物的基础研究等方面具有独特优越性。在动植物中，更小的编辑系统意味着载体构建和递送更容易以及装载量更大，这使得其应用范围更加广泛。但是IscB和TnpB也存在TAM 序列限制较大导致的可编辑位点较少、在真核生物上编辑效率较 Cas9 和 Cas12a 更低等问题。因此，基于 IscB 和 TnpB 的新型基因组编辑系统有着广泛的应用场景和极高的可提升空间，是未来基因组编辑工具的重点研发对象，在临床医疗和农业育种中有重要的作用。
柴楠和刘雨馨为该文章的共同第一作者，刘耀光院士和祝钦泷研究员为该文章的共同通信作者。相关工作由国家重点研发计划项目(2022YFF1002802) 和国家自然科学基金面上项目(32272120) 共同资助。
柴楠，刘雨馨，张瑞祥，等，2023. 基因组编辑工具的发展：从 CRISPR / Cas9 到 TnpB. 基因组学与应用生物学，42 (12)：1267-1274. [ CHAI N, LIU Y X, ZHANG R X, et al., 2023. Development of genome editing tools: from CRISPR / Cas9 to TnpB. Genomics and Applied Biology, 42(12): 1267-1274.]
