双特异性抗体（bsAbs）是一种通过基因工程技术构建的重组蛋白，它们具备两个不同的抗原结合位点，能够同时识别并结合两个不同的抗原或表位。这一概念最初由Nisonoff和Rivers在1961年提出，并在1964年由Fudenberg等人通过实验验证。随着基因工程技术、蛋白质结构预测和模拟技术以及生产技术的不断进步，bsAbs的研究和开发在过去几十年中取得了显著的发展。如表1所示，bsAbs展现出多样的作用机制（MoA），包括但不限于细胞桥接（例如mosunetuzumab-axgb）、凝血因子桥接（例如emicizumab-kxwh）、受体激活或阻断（例如ozoralizumab和faricimab-svoa）、受体或配体的内化或聚集、辅因子模拟（例如emicizumab-kxwh），以及重新定向细胞毒性效应细胞。这些作用机制使得bsAbs在治疗多种疾病，尤其是癌症治疗领域，展现出巨大的潜力和应用前景。
图1：美国和全球双特异性抗体 (bsAb) 每年的监管批准 (左轴) 和趋势线 (右轴)。
截至2023年年末，全球已有14种双特异性抗体（bsAbs）获得了监管机构的批准（参见表1和图1）。这些获批的bsAbs中，大多数被应用于肿瘤免疫治疗领域，而少数则用于治疗慢性炎症性疾病和血液相关疾病（参见图2）。目前，获批用于肿瘤免疫治疗的bsAbs主要靶向T细胞上的两种免疫调节蛋白，或者是内皮细胞上的其他靶点，以及T细胞上的CD3蛋白与癌细胞上的肿瘤相关抗原。这些肿瘤相关抗原的例子包括上皮细胞黏附分子（EpCAM）、CD19或CD20、B细胞成熟抗原（BCMA）、G蛋白偶联受体（GPCR5D）以及糖蛋白100（gp100）。这些bsAbs的开发和应用，为肿瘤治疗提供了新的策略和方法。
表 1：监管机构批准的双/多特异性抗体列表；BCMA = B 细胞成熟抗原、CD = 分化簇（蛋白质）、EMA = 欧洲药品管理局、EpCAM = 上皮细胞粘附分子、FDA = 美国食品药品管理局、gp100 = 糖蛋白 100、GPCR
= G 蛋白偶联受体、HLA = 人类白细胞抗原、IgG = 免疫球蛋白 G、scFv = 单链可变片段、VEGF
= 血管内皮生长因子、VHH = 可变重链（片段）、wd = 撤回。
图2：14 种已获批准的双特异性抗体（bsAbs）的应用。
T 细胞衔接器 (TCE) 可重定向细胞毒性 T 细胞以杀死癌细胞，通过 CD3 激动激活 T 细胞，并在 T 细胞和癌细胞之间形成强大的细胞溶解突触，从而产生细胞溶解性抗肿瘤反应。已获批的 9 种 bsAb 靶向 TCE。
•CD3/CD19（blinatumomab）
•CD3/CD20 用于治疗复发或难治性 (R/R) 滤泡性淋巴瘤 (mosunetuzumab-axgb)
•CD3/CD20 用于 R/R 弥漫性大 B 细胞淋巴瘤（例如epcoritamab-bysp 和 glofitamab-gxbm）
•CD3/BCMA 用于治疗 R/R 多发性骨髓瘤（teclistamab-cqyv 和 elranatamab-bcmm）
•用于治疗眼癌的 CD3/gp100 肽-人类白细胞抗原(HLA) (tebentafusp-tebn)
•CD3/EpCAM 用于治疗恶性腹水（catumaxomab）
•CD3/GPRC5D 用于R/R 多发性骨髓瘤（talquetamab-tgvs）。
目前，超过200种双特异性抗体（bsAbs）正在临床阶段接受测试，它们被用于放射免疫治疗、抗病毒感染治疗（如埃博拉病毒）、神经退行性疾病治疗（如阿尔茨海默病）以及肿瘤治疗（特别是针对实体瘤）。生物制品从研发到最终商业化是一个漫长且成本高昂的过程，且监管机构的批准率相对较低（参见图3）。以治疗血友病A的药物Hemlibra（emicizumab-kxwh）为例，其从研发到获得批准耗时超过15年。
图3：生物药研发（R&D）路线图；BLA = 生物制品许可申请、GCP/GLP/GMP = 良好临床/实验室/生产规范、ICH = 国际协调理事会、IND= 新药研究（申请）。
在药物开发的初期阶段，关键在于根据分子的物理化学特性、形态、靶标专一性、药代动力学（PK）以及预期的治疗效果来筛选出最佳的候选药物（参见图3）。基于众多双特异性抗体（bsAbs）商业化项目中积累的经验和教训，本文将着重探讨基于bsAbs物理化学特性的化学、制造和控制（CMC）的关键考量因素。我们将聚焦于质量和监管标准，以及在开发检测方法、生产工艺和制剂过程中可能遇到的挑战。我们的目标是将这些宝贵的经验应用于未来bsAbs产品开发计划中，以提高开发效率和成功率。
从bsAb 理化性质考虑
双特异性抗体（bsAbs）的关键物理化学特性涵盖了分子的尺寸、蛋白质序列、二级和三级结构、疏水性、电荷特性、翻译后修饰（PTMs，如糖基化、环化、脱酰胺、氧化和剪切）、等电点（pI）以及分子的构型。至今，已有超过100种bsAbs的结构形式和30多种技术平台被报道。结构形式的选择，如免疫球蛋白（IgG）或抗体片段，是基于特定分子的治疗目标、作用机制（见表1）以及功能性和可开发性来决定的。在商业化的bsAbs中，有11种是基于IgG构建的（例如IgG1、IgG2、IgG4），而7种是基于IgG的TCE（T细胞接合器）。基于IgG的bsAbs拥有与天然/野生型人抗体相似的可结晶片段（Fc）结构。Fc介导的效应功能涉及抗体依赖性细胞介导的细胞毒性作用（ADCC）、补体依赖性细胞毒性作用（CDC）和抗体依赖性细胞吞噬作用（ADCP）。这些功能对于bsAbs的疗效和安全性至关重要。
Fc区域对于抗体的半衰期延长、稳定性增强和溶解度提升起着关键作用，并且使得通过Protein A亲和层析纯化过程更为便捷。然而，基于IgG的双特异性抗体（bsAbs）在表达水平、产量、聚集倾向以及同型二聚体和其他副产物的形成方面存在一些挑战。为了降低杂质水平并提高产品的生产效率，研究者们已经开发出多种结构改良方法，例如knob-into-hole技术以及罗氏公司的CrossMab技术。为了减少Fc区域介导的效应功能，一些开发者选择了Fc沉默策略（如mosunetuzumab）或使用抗体片段（如blinatumomab）。这些策略有助于优化bsAbs的性能，同时减少不必要的免疫反应和提高治疗效果。
三种获批的、基于片段的双特异性抗体（bsAbs）相较于含有Fc区域的双特异性抗体，具有以下优势：它们体积更小、结构更简洁、对组织的渗透力更强以及具有更高的构象灵活性。在生产工艺方面，基于片段的bsAbs更易于纯化和生产，且产量更高。然而，缺少Fc结构域可能会导致分子稳定性降低和血清半衰期缩短。为了解决这些问题，采取了一些策略，例如通过冻干技术（如blinatumomab）来增强稳定性，以及通过改造人血清白蛋白（HSA）结合结构域来延长半衰期（如ozoralizumab）。这些方法有助于提高基于片段的bsAbs的疗效和安全性，同时优化其药代动力学特性。
工艺开发中的考虑因素
在生物药物领域，一旦从药物发现阶段筛选出双特异性抗体（bsAb）候选物，工艺开发和化学、制造与控制（CMC）活动便随之启动。这一阶段涵盖了多个关键环节，包括：
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细胞系构建（CLD）：开发稳定的细胞系以生产目标蛋白。
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细胞培养工艺优化（CCPD）：建立和优化细胞培养条件，以提高蛋白产量和质量。
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下游纯化工艺开发（DSPD）：设计和实施纯化流程，以分离和纯化目标蛋白。
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分析方法开发（AMD）：开发用于质量控制的分析技术，确保产品的一致性和安全性。
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制剂开发和稳定性研究：研究药物的配方，以及在不同条件下的稳定性。
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药物底物（DS）生产支持：确保药物底物的生产满足质量要求。
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药物产品（DP）灌装/完成：在无菌条件下完成药物产品的灌装和包装。
图4：双特异性抗体 (bsAb) 开发的关键考虑因素；SQIPE= 安全性、质量、特性、纯度和功效。ELISA= 酶联免疫吸附试验，HVAC = 供暖、通风和空调，LC-MS = 液相色谱质谱法，pI = 等电点，SEC-HPLC = 尺寸排阻高效液相色谱法，SDS-PAGE = 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳。
在考虑化学发光检测（CLD）和细胞培养产品检测（CCPD）时，需要关注以下几个关键点：首先，宿主细胞系的筛选是至关重要的，它直接影响到蛋白表达的效率和质量。其次，对基因密码子和信号肽进行优化，可以提高目标蛋白的表达水平和分泌能力。再者，设计遗传载体时，需要考虑复制起点、抗生素抗性基因、启动子和增强子等要素，以确保基因的稳定表达。此外，基因转染技术的选择，如聚乙烯亚胺或脂质体，也对实验结果有着显著影响。最后，对克隆进行筛选，以获得高表达的稳定细胞株。
中国仓鼠卵巢（CHO）细胞系，如CHO-K1和CHO-GS，因其对生物工艺的适应性、快速生长特性以及能够进行与人兼容的翻译后修饰（PTM），而被广泛用于单克隆抗体（mAb）和基于IgG的双特异性抗体（bsAb）的生产。尽管如此，CHO细胞的遗传不稳定性可能会导致生长速度、表达量和产品质量的下降，这是由于染色体重排和PTM的变化所引起的。因此，在应用CHO细胞系进行蛋白生产时，需要对其遗传稳定性进行严格监控和评估。
克隆选择依赖于细胞生长特征，涵盖表达水平、细胞活力、活细胞浓度（Viable Cell Density, VCD）、代谢活动、克隆纯度、基因副本数量、遗传稳定性和表型一致性、产品品质（包括单体、聚集体、片段、同源二聚体、错配物以及糖基化和电荷变异体的比例）、结合能力（通过免疫分析或细胞基础分析测定）以及生物安全性（内毒素水平、微生物污染和病毒污染）。糖基化是影响药物吸收、血浆半衰期、免疫原性和血浆清除率的关键质量属性（Critical Quality Attribute, CQA）。基于单链可变区（Single-chain Variable Fragment, scFv）的双特异性抗体（bsAb），如blinatumomab和tebentafusp，可通过中国仓鼠卵巢（Chinese Hamster Ovary, CHO）细胞或大肠杆菌表达。
在选定最优克隆后，将建立研究细胞库（RCB），该库用于细胞培养工艺开发（CCPD）的培养基筛选、补料策略优化和工艺参数的确定。RCB在宿主细胞特性分析、稳定性评估和生物安全性测试中发挥关键作用。随后，将制备主细胞库（MCB）和初始工作细胞库（WCB），以支持大规模生产活动。在此过程中，通常会识别关键工艺参数（KPP）和关键工艺参数（CPP），这些参数用于监测从细胞库制备（CLD）到细胞培养工艺开发（CCPD）以及下游工艺开发（DSPD）的工艺表现和产品质量属性（CQA），例如糖链结构、电荷特性和安全性。例如，唾液酸化水平或唾液酸含量对产品的功能性和稳定性有显著影响。从CCPD的角度来看，培养基中较低的葡萄糖浓度（低于0.7 mM）会减少唾液酸化作用，并增加甘露糖的添加。此外，可以通过添加培养基成分（如半乳糖、葡萄糖胺、N-乙酰葡萄糖胺、地塞米松和锰）和/或控制细胞培养过程（例如保持高溶解氧（DO）和适当的葡萄糖补充，以减少乳酸积累和甘露糖合成）来增强唾液酸含量。
在制备生物制品时，必须确保所使用的动物源性原料不含朊病毒等病原体，并避免将其用于培养液和缓冲液中，以遵循良好的生产规范（GMP）。同时，还应检测原料中是否含有亚硝胺等潜在致癌物质，并禁止其使用。原料的药典等级应满足目标市场药典的标准。应从能够提供分析证书（CoA）的可靠供应商处采购原料。对于非药典级别的原料，必要时应从经过认证的供应商处采购，并依据既定的临床和/或商业产品的验收标准进行检验。
DSPD 工艺设计、开发和规模放大的考虑因素：
双特异性抗体（bsAb）的提纯技术应追求高效率、可扩展性、稳定性、可复制性和可控性，以实现尽可能高的产量。所得到的纯化产品需满足既定的安全、质量、特性、纯度和效能（SQIPE）标准。对于基于IgG的bsAb，成熟的单克隆抗体（mAb）纯化平台技术能够有效支持早期的临床研究，节省时间、资源和成本。这一平台涵盖了产品的亲和层析捕获，随后通过低pH或去污剂处理以灭活逆转录病毒，离子交换和/或混合模式层析以去除杂质和病毒，病毒过滤（VF）用于清除小病毒，切向流过滤（TFF）用于制剂的浓度和纯化，以及0.22微米过滤用于控制生物负荷。
中间和精制层析步骤对于清除生产过程和产品中的相关杂质至关重要。例如，混合模式层析技术（如Cytiva公司的CaptoMMC ImpRes介质）和阳离子交换层析（如Cytiva公司的Capto S ImpAct介质）能够有效去除与产品相关的杂质（如聚集体和片段）以及与工艺相关的杂质（如宿主细胞蛋白、HCP）。对于基于片段的双特异性抗体（bsAb），必须开发替代的纯化策略。轻链亲和捕获技术就是一个这样的实例。
为了维持工艺的连贯性、提高产量和满足产品SQIPE标准，在放大生产过程中，必须对层析柱的性能进行严格控制，包括其不对称性和与理论塔板高度（HETP）的关系。填料的高载量和可重复使用性有助于减少层析操作中的原材料成本。同时，减少最终超滤/透析（UF/DF）和深层过滤（DS）过程中的系统滞留体积，可以限制产品在管道、过滤器和系统中的损失，特别是在DS浓度较高（超过100 g/L）的情况下。
当双特异性抗体（bsAb）项目进展到临床试验的后期阶段，必须依据工艺表征（PC）和工艺验证（PV）的结果，确立关键工艺参数（KPP）和产品的关键质量属性（CPP），以便将这些信息纳入生物制品的上市申请（BLA）或其他监管文件中。
分析考虑：
分析方法开发（AMD）在工艺开发和生产支持中扮演着至关重要的角色。这些方法用于评估物理化学属性和提供工艺支持，包括过程监控、制剂设计、强制降解研究、DS/DP的质量放行以及稳定性评估、参考标准的建立、蛋白质特性分析、相容性测试和相似性测试。所开发的方法对于监控和控制生产过程的表现、产品的纯度、聚集体、片段、DS特性、分子尺寸和结构、电荷变异体、糖基化水平、稳定性、安全性和效能至关重要。
在产品研发的早期阶段，可以利用标准化的酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒（例如Cygnus Technologies提供的产品）来监测宿主细胞蛋白（HCP）等杂质。为特定产品定制的方法需要经过验证和确认，以便用于支持生物制品上市申请（BLA）。为了评估双特异性抗体（bsAb）的多重结合特性，通常会从研发早期到后期开发两种或更多结合性的ELISA方法。此外，还需要基于细胞的检测方法来辅助BLA的申请。
分析方法开发（AMD）在工艺表征和验证阶段对关键质量属性（CQA）的评估中扮演着至关重要的角色。CQA可能涉及产品特性（如一级结构）、作用机制（如T细胞激活或抗原结合）、电荷变异体（如酸性或碱性异构体）、翻译后修饰（如糖基化、脱酰胺和氧化）、杂质（如聚集体、片段、宿主细胞蛋白（HCP）、宿主细胞DNA以及残留的Protein A）和外来因素（如生物负荷、内毒素和病毒）。聚集体和/或片段通常被视为CQA，因为它们可能影响产品的安全性和效能。常用的放行和稳定性验收标准或设定聚集体和片段控制规范的方法包括还原/非还原十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）或毛细管电泳（CE-SDS）以及使用尺寸排阻（SEC-HPLC）或反相（RP-HPLC）介质的高效液相色谱（HPLC）。
必须严格控制内毒素水平，以降低患者产生免疫反应的风险。关键质量属性（CQA）的标准制定可能依据临床研究数据、产品特性知识、研发者的经验、制剂开发研究、储存条件、工艺效能和生产实践经验。
制剂和稳定性的考虑：
bsAbs的制剂研究评估许多DP成分、特性和操作：
• DS 完整性（序列、结构、聚集、降解、折叠和组装）、效力和功能
• 缓冲液（例如醋酸盐、柠檬酸盐、组氨酸和磷酸盐）
• pH、蛋白质浓度、粘度、渗透压、温度、湿度和光照
• 赋形剂（例如表面活性剂、氨基酸和糖）
• 容器和封盖（例如小瓶、注射器或袋子）
• 制剂操作（例如剪切力和冻-融循环）。
这些测试评估了与缓冲液pH值和辅料相关的变化，通常涵盖短期“加速”稳定性研究，以评价渗透压和电荷分布；蛋白质浓度和表面活性剂的作用；药物制剂的外观和可见/不可见颗粒的有无；以及单体、聚集体和片段的相对比例。
鉴于双特异性抗体（BsAb）在N端环化（例如谷氨酰胺、谷氨酸）、C端赖氨酸断裂、糖基化、糖化、唾液酸化、脱酰胺（例如天冬氨酸、谷氨酰胺）和氧化（例如蛋氨酸）等方面存在多样性，因此制定BsAb的制剂条件可能面临挑战。与糖基化相关的多样性可能会影响药物的活性、安全性、效能、药代动力学和稳定性。表2提供了表1中列出的已上市BsAb产品的制剂成分、pH值、蛋白质浓度和剂型（如冻干、液体）等信息。这些数据可以作为开发人员筛选新BsAb制剂方法的起点，并有助于节省时间、资源和成本。制剂开发人员还可以参考单克隆抗体（mAb）和其他蛋白质药物制剂的先前经验，优先考虑使用“公认为安全”（GRAS）列表中的辅料，并仅在必要时才考虑使用其他辅料。
表2：监管机构批准的双/多特异性抗体药物产品的制剂、剂量和稳定性信息。ADA= 抗药抗体，EDTA = 乙二胺四乙酸，PS = 聚山梨醇酯，WFI = 注射用水
在进行药品稳定性研究时，一个普遍接受的做法是，在向美国提交新药临床试验申请（IND）或向欧洲提交肿瘤治疗临床试验药品档案（IMPD）时，提供为期一个月的加速稳定性数据，并在临床试验过程中随着更多数据的获得而补充这些信息。临床前阶段的药品（DS）批次质量应与用于临床研究的材料相匹配。对于后期开发阶段，生物制品上市申请（BLA）和其他相应的监管文件中至少需要包含三个批次，且至少应有六个月的稳定性数据。对于制剂（DP），至少六个月的稳定性期限应根据具体情况确定。临床前研究中使用的制剂容器质量应与临床试验中使用的质量相一致。稳定性测试应在加速和应力条件下的适当温度、湿度和光照条件下进行，以评估制剂的强度、效能、纯度和特性——包括浓度、外观、无菌性、稳定剂和容器封闭的完整性。
规模放大/缩小的注意事项：
在细胞系开发（CLD）过程中，通常需要评估60至80代细胞的表型和基因型稳定性，以支持大规模生产（例如10,000升生物反应器）。对于较小规模（不超过2000升）的生产，通常只需评估至45代。在细胞培养过程开发（CCPD）中，应在不同规模的生产中使用相同的培养基和工艺参数。强烈推荐在不同规模中使用相似的生物反应器设计；如果不同，则需要建立可靠的放大/缩小模型。对于纯化过程，层析柱的高度应与保留时间、上样量、上样速率、峰切割、pH值、电导率、缓冲液成分、冲洗和洗脱液体积、填料质量等参数在整个生产规模范围内保持一致。病毒过滤（VF）操作应使用相同类型的滤器、上样速率（L/m²）和压力（psi或bar）、工艺暂停时间以及完整性测试。切向流过滤（TFF）操作也应遵循同样的原则。
