抗体-寡核苷酸偶联物（AOC）的偶联、纯化及表征分析

1. 前言

前面我们分享了很多关于抗体偶联药物（ADC）的内容，今天我们一起学习一下新型抗体偶联药物-抗体-寡核苷酸偶联物(AOC)的内容。我们知道ADC存在脱靶毒性的风险，虽然ADC的选择性是通过抗体实现的，但仍可观察到非特异性毒性。 如果可以使用更精确的有效载荷，协同组合可能会产生更有选择性和更安全的ADC。寡核苷酸属于这类精确的有效载荷，因为它们能够通过引导特定的基因来阻止蛋白质的产生。 小干扰RNA（siRNA）和反义寡核苷酸（ASO）在过去的十几年中发展迅速。 尽管寡核苷酸具有选择性，但它们也面临着诸如血清稳定性短、膜通透性低和缺乏组织选择性等挑战。 抗体具有较长的半衰期，能够选择性地在细胞内递送治疗药物，以及靶向特性，使其成为靶向递送寡核苷酸的理想介质。

ADC由于非选择性载荷而具有全身性毒性，但寡核苷酸的选择性可以增强偶联物仅影响靶疾病细胞的能力。将siRNA和ASOs的高精度与抗体的递送性相结合，从而协同了这两种技术的优势。AOCs最初开始开发是作为一种强大的诊断工具的手段，但最近已经发展成为许多疾病的靶向治疗方法。随着寡核苷酸领域的成熟，选择性组织传递成为临床应用的一个重要挑战，AOCs转化为潜在的单药治疗药物。在过去的十几年中，ADC和寡核苷酸领域在化学、偶联和分析方面都有了巨大的技术进步，这增加了 AOC成药性的可能。 本文也将讨论ADC 和AOC之间的差异和相似之处。虽然ADC和AOC的开发和制备的某些方面有相似之处，但又各自存在挑战。

2. 寡核苷酸与抗体的偶联

ADC中小分子药物与抗体采取直接偶联的方式。而寡核苷酸与典型的小分子相比有更多的偶联方法。图1展示了用于制备AOCs 的四种通用方法。这些方法包括 离子相互作用（图 1A)、亲和结合（图1B)、直接偶联（1C）和双链作为偶联部分的利用（图1D)。

图 1.AOC偶联方式：(A)静电相互作用、(B)生物素与亲和素之间的亲和、(C)直接与抗体 偶联、 (D)使用双链杂交的偶联寡核苷酸

将寡核苷酸与蛋白质偶联与传统的小分子偶联不同， ADC制备的挑战包括药物连接剂的异质性、疏水性、连接剂的聚集性和稳定性。 药物的大小及其电荷对ADC的制备存在影响，但在AOC中，这些影响更大。例如，ADC中典型药物连接物的分子量（MW）小于2kDa，而寡核苷酸较大，其分子量可大于10kDa。这意味着寡核苷酸对偶联抗体（150kDa）的物理和化学性质的影响将大于小分子。 因此，用于ADC的分析和纯化方法可能不适用于AOC。

寡核苷酸由于其带负电荷的磷酸骨架，是水溶性的，这与ADCs中的一般水不溶小分子有区别。另一方面，寡核苷酸的电荷对偶联也有很大的影响，因为会影响整个抗体的电荷。传统的ADC小分子通常是中性的或具有少于两个电荷/药物连接剂，偶联不会显著改变母体抗体的性质。尽管抗体和ADC的icIEF和IEX色谱有一定差异，但是他们还是有很多相似之处，纯化及分析方法可能可以通用。然而，寡核苷酸本质上带负电荷（超过20个负电荷），并将决定AOC的整体电荷分布。因此，传统方法可能不适用于AOC的分析和表征。例如，虽然大多数基于质谱（MS）表征ADC的方法均使用正离子模式的检测，但在这些检测条件下，具有许多负电荷的AOC几乎是不可见的。ADC和AOC特性的另一个主要区别是如何计算药物/寡核苷酸与抗体的比率,即DAR或OAR值。 我们知道，ADC的DAR值表征可以用反相HPLC或疏水相互作用色谱（HIC），这依赖于药物连接剂的疏水性。但这些色谱方法却不能用于寡核苷酸与抗体的比值（OAR）的测定 。对于ADC，偶联物的性质与抗体接近。对于AOC，偶联物的性质与抗体和寡核苷酸相似。由于这些差异，ADC纯化和分析的的新技术不适用于AOC，需要新的方法来纯化和表征AOC。

2.1 通过离子相互作用进行偶联

在寡核苷酸上添加可连接的基团并不简单。然而，寡核苷酸主链的负电荷为制备偶联物提供了条件。为此，抗体与多阳离子部分，如鱼精蛋白或聚精氨酸的初始融合或修饰允许进行一般的偶联过程。寡核苷酸主链的负电荷和鱼精蛋白的正电荷通过离子相互作用与寡核苷酸和蛋白质强烈地结合。这种方法适用于许多类型的寡核苷酸，因为它不需要任何化学修饰。鱼精蛋白是最常用的多阳离子组，因为它是在精子中发现的一种内源性蛋白质，并已被用来延迟胰岛素的活性。该方法简单、灵活，允许不同的寡核苷酸与聚阳离子蛋白质结合。离子偶联的另一个优点是，一旦寡核苷酸进入细胞，多阳离子复合物就可以作为溶酶体逃逸剂。在溶酶体中，多阳离子配合物充当质子海绵，氯离子在内部扩散，以补偿电荷不平衡引起的渗透膨胀，从而导致膜渗漏。这种溶酶体逃逸是很重要的，因为寡核苷酸不具有很强的膜透性，这允许更多的寡核苷酸进入细胞质。然而，这种方法的主要缺点是离子的相互作用是可逆的。共轭物可能不稳定，特别是在改变pH或盐浓度的情况下。离子相互作用偶联的另一个缺点是难以确定OAR，需要通过荧光或PCR扩增来完成。

2005年，利伯曼研究小组发表了第一个抗体介导的siRNA传递的例子。在这项工作中，他们制备了一种抗体-鱼精蛋白融合物。用它传递siRNA对抗HIV-1衣壳基因gag。使用荧光素异硫氰酸酯（FITC）标记的寡核苷酸，观察到每个鱼精蛋白可以结合大约6个siRNA分子。该抗体片段靶向HIV-1包膜，这导致仅在体外HIV感染的原代T细胞中抑制HIV复制。由于没有HIV的体内模型，用HIV包膜转染了一个癌细胞系（B16），并制备了抑制c-myc、MDM2和VEGF等致癌基因的siRNA。Baumer小组制备了一种鱼精蛋白抗EGFR抗体，结果表明，一种针对KRAS的siRNA在体外和体内均表现出活性（图2）。值得注意的是，KRAS一直是一种众所周知的难以使用标准小分子方法进行抑制的致癌基因。Baumer小组比较了与半胱氨酸和赖氨酸相关的鱼精蛋白与抗体融合结构。融合抗体与化学修饰抗体的活性相似，但连接体修饰方法的活性更高。同样据报道，一种SMCC-鱼精蛋白抗体-siRNA偶联物可以抑制TRIM24，后者在前列腺癌中过表达。一种前列腺特异性膜抗原（PSMA）抗体显示FAM-siRNA 的选择性内化。与阴性对照组相比，PSMA AOC在体内外均表现出强大的活性。

图2.使用Sulfo-SMCC结合的鱼精蛋白

在另一种利用离子相互作用偶联的方法中，抗体上的赖氨酸残基最初用Traut试剂衍生，并进一步细化成二硫化物聚精氨酸偶联手柄（图3）。

图 3.聚精氨酸偶联

Schultz研究小组遵循了类似的策略，使用RAFT聚合创建了一个聚精氨酸共聚物（图4）。聚合物的一端含有羟胺，通过与非天然氨基酸对乙酰苯丙氨酸（pAF）缩合形成肟键。然后，阳离子聚合物可以与带负电荷的寡核苷酸主链发生反应。在这个例子中，使用FITC标记的寡核苷酸来展示使用曲妥珠单抗修饰的抗体对癌细胞的靶向递送。通过对siRNA靶标GAPDH mRNA水平的PCR检测，测定了AOC的降解活性。

图4. 聚精氨酸共聚物偶联

利用静电相互作用来结合寡核苷酸是一种可行的方法，它可以灵活地应用于不同类型的寡核苷酸。离子偶联的一个优点是，多聚阳离子帮助寡核苷酸逃离核内体或溶酶体。这些偶联物与附着的寡核苷酸数量相关的特征通常通过PCR或荧光标记的寡核苷酸来完成。然而，还需要更全面的研究来进一步了解其在体内的稳定性、释放速率和ADME的特性。

2.2 基于亲和素的偶联

在类似的方法中，利用生物素标记的寡核苷酸和亲和素之间的强相互作用，也成功地生成了AOCs（图1B），使用该技术生成的偶联物显示了基因抑制，这可以通过转染人293细胞与荧光素酶基因来观察到。一种对人胰岛素受体的抗体显示，48 h后达到最大抑制90%，7天后无抑制活性。基于亲和素的偶联物的优点是所合成的偶联物在体内的稳定性。多阳离子复合物由于盐浓度的变化可能会发生体内聚集，但生物素复合物对这种影响较小。虽然这是一种有效和实用的偶联方法，但它仍然涉及用生物素或链霉亲和素对抗体和寡核苷酸或鱼精蛋白进行化学修饰。即使链霉亲和素和生物素之间的结合是强而有效的，它提供了一个稳定的键，但这种生成AOCs的方法相较于鱼精蛋白方法需要更多的步骤。

2.3 直接偶联

直接偶联方法更类似于 ADC，将一个可连接的基团添加到寡核苷酸上，然后偶联到抗体的赖氨酸、半胱氨酸或工程氨基酸上。 这种方法允许使用在ADC中发现的相同的多功能性连接剂，如可裂解和不可裂解的连接剂。 与较大的鱼精蛋白或亲和蛋白复合物相比，这种方法的优点是连接物更小，对整体结合物的影响较小。另一方面，每个寡核苷酸结构必须包含一个连接器手持，并经过化学修饰以连接连接器。连接器必须在 DNA或RNA及其双链退火过程中兼容和稳定。siRNA中的连接子通常被整合到正义链中，而不是反义链中。选择正义链的原因是，反义链是在导致基因沉默的RNA诱导沉默复合物（RISC）中使用的一种。正义链的修饰消除了残留的连接基团或修饰后的核苷酸干扰siRNA与RISC结合的可能性。与离子偶联相比，直接偶联法制备的AOCs不加入溶酶体逃逸剂。因此，这可能会导致寡核苷酸从溶酶体中缓慢逃逸，从而影响AOC的活性。控制ADC中DAR的一种有效方法是在抗体上引入工程位点特异性半胱氨酸，提高ADC在体内的整体特性。由基因泰克公司开发的位点特异性半胱氨酸工程抗体被命名为Thiomab™，与ADC类似，各种Thiomab™抗体使用SMCC和SPDB型连接物偶联到21分子的寡核苷酸上（图5）。

图5.与寡核苷酸的直接偶联

使用多种不同连接体类型的直接偶联方法，Sugo小组能够用siRNA靶向骨骼肌和心肌（图6）。采用实时聚合酶链反应测定siRNA的存在量。siRNA负载（OAR）的化学计量在每 个 Fab' 上为 1.0到2.2之间变化。

图 6.通过磷酸盐主链偶联

另一种直接偶联的方法使用dbco-叠氮化物点击或其他称为菌株促进叠氮化物-炔环加成（SPAAC）反应来生成偶联物，如图7所示。该方法的优点是可以将一批具有相同连接比的抗体功能化，并且可以将不同的寡核苷酸正交偶联。调整DBCO和/或叠氮化物修饰的寡核苷酸的量产生OAR组分。将叠氮偶联到抗体上并使用一种DBCO修饰的寡核苷酸的反向反应也被证明是成功的。在制备用于诊断的AOC时，通常采用直接共轭的点击法。由于Click化学的正交性和寡核苷酸的相容性，这是一种有前景的偶联方法。由于寡核苷酸的水溶性，DBCO和BCN试剂的疏水性不会带来挑战。

图7.基于叠氮化物-炔点击化学的偶联

寡核苷酸的偶联也可以使用与生成均质ADC中使用的相同位点特异性连接技术，通过添加含叠氮化合物的间隔物和与转谷氨酰胺酶兼容的连接子，使用位点特异性连接制备了OAR为2的AOC（图8），通过SDS-PAGE分子量测定，添加到DBCO官能化寡核苷酸可以进行点击反应，生成具有OAR为2的均质AOC。

图8. 谷氨酰胺酶点击化学

另一种有意思的直接偶联方法是使用二琥珀酰亚胺连接子（图9），其为双功能连接子，但当加入过量的连接子时，主要产物是连接子-寡核苷酸。然后共价结合到抗体赖氨酸上。该方法成本较低，经济快捷。

图9.二琥珀酰亚胺基连接剂

使用非天然pAF基团，生成一个含有曲妥珠单抗的AOC。使用该AOC作为PCR引物，以更高的精度和灵敏度检测Her2+样本的存在。这展示了正交肟连接剂化学作为一种蛋白质标记工具的多功能性。

有一种位点特异性赖氨酸偶联，其中-内酰胺可以选择性地与H38C2抗体发生反应，如图10所示。这个隐藏的赖氨酸pKa值较低（6.0），由于存在可及的疏水口袋。而其对亲电试剂的反应性又增加了一个数量级。一个靶向额外可变结构域（Her2或BCMA）被添加到H38C2抗体中，产生AOCs。利用SDS-PAGE得到，得到的OAR为2。

图10.β-内酰胺偶联

直接偶联法相对来说比较灵活，关键是选择接头以及寡核苷酸偶联位置， 直接偶联法有可能是未来制备AOC的首选方法。

2.4 DNA杂交技术偶联

通过杂交方法可以获得带有双链寡核苷酸的AOC，首先将单链寡核苷酸偶联到抗体上，然后将互补链杂交形成双链AOC，双链杂交的动力学大概为＞10 ⁶ m.s-1，比点击化学和其他偶联方法快几个数量级。使用西妥昔单抗作为递送阿霉素的靶向剂，阿霉素可以通过插入寡核苷酸双链传递到细胞（图11），该策略允许将多达480个阿霉素分子与抗体结合。

图11.阿霉素插入到AOC的3D结构

AOC是类似于ADC的细胞毒素的载体（图12A）。使用双链寡核苷酸在每个DNA分子中插入约8个阿霉素，这显著增加了阿霉素对细胞的传递。在另一个例子中，使用直接附着的方法形成了一个包含单链寡核苷酸的AOC，将一个互补链与ADC药物连接物连接并进行杂交（图12B）。第一个例子中，第一个寡核苷酸链使用链间二硫化物偶联到抗体上，得到多种OAR，这是通过调整在还原步骤中使用的TCEP的量来控制的。互补DNA策略用硫醇或胺对DNA进行修饰，结合MC-Val-Cit-PAB-MMAE，SMCC-DM1或者直接DM1,OAR范围为1.9-4.6。体外活性随OAR的增加而增加，观察到的活性与T-DM1相当。在另一个例子中，单链寡核苷酸通过赖氨酸两步点击偶联过程进行偶联。该互补链通过在3‘处有一个半胱氨酸残基来偶联到MC-Val-Cit-PAB-MMAE上，以添加药物连接体。OAR分布在0-5之间变化，经native MS测定，平均OAR为1.9。体外检测数据表明，其对阳性细胞具有选择活性，但比直接偶联到连接体有效载荷上的曲妥珠单抗（Val-Cit-PAB-MMAE）低100倍左右。作者认为，这可能是由于寡核苷酸的负电荷，降低AOC的内化。

图12. （A）阿霉素相互作用（B）药物的杂交

寡核苷酸的长度对于杂交方法非常重要。如果寡核苷酸序列过短，则双链结构在血浆中就不够稳定，如果太长，可能形成二级结构。在用阿霉素插入的情况下，序列的长度决定了AOC可以携带的阿霉素的数量。尽管动力学高于点击化学，但将一个连接体-有效载荷连接到一个寡核苷酸上的成本似乎并不有利于通过杂交进行偶联。这种杂交技术在诊断方面应该前景很好，但它似乎对AOC 来说还具有很大的挑战性。

2.5 总结

上述介绍了4种产生AOC的方法。目前大多数AOC的OAR小于4，但像 ADC一样，这种情况可能会随着时间的推移而改变。 目前用于确定 OAR和分布的方法对AOC 来说还有巨大挑战。 将荧光探针附着在寡核苷酸上确实可以测量 OAR作为平均值，但如果没有进一步分离组分，它们的分布则是未知的。PCR是一种确定OAR的有效方法，但分布也不清楚。由于寡核苷酸的大小和电荷，SDS-PAGE和IEX已被用于分离物种并确定其分布。质谱法已用于OAR的测定，特别是均相偶联。一般的表征分析方法仍然是一个挑战，随着该领域的成熟， 相信问题会逐渐得到解决。

3. 体外数据

本节将介绍体外数据的使用，显示基因沉默、细胞毒性、内化动力学和AOC的制备。如果AOC与ADC遵循相似的模式，那么体外和体内结果之间可能几乎没有相关性。尽管如此，这些体外研究可以帮助阐明一些偶联物之间的细微差别。体外测试对于了解AOCs在体内活性中发挥重要作用的参数是必要的。当涉及到体外机制和控制时，与ADC和其他治疗药物相比，寡核苷酸确实有一些优势。例如，只要有一个相同长度和类型的随机寡核苷酸序列，就可以得到一个阴性对照。在义链或反义链上添加一个荧光团，允许同时跟踪治疗和测量其与相同结构的活性。简而言之，一个设计良好的AOC可以提供不同水平的信息，从细胞毒性到稳定性，最后到一个分子 的成像。

3.1 评价基因抑制

AOC的功效将取决于其抑制蛋白质生产的能力。AOC敲除基因的能力可以通过测量mRNA、蛋白印迹或将绿色荧光蛋白（GFP）纳入系统来实现。与荧光团结合，基因沉默活性和转运可以共同关联。Xia等人的一项研究表明，通过荧光素酶活性后，在48 h观察到最高水平的基因沉默，其沉默活性在第7天消失。大多数研究测量了24小时到72小时之间的基因沉默活性，因为这通常是最大的基因抑制的时间。目前，尚不清楚活性抑制的最低水平，也不清楚它是否与体内数据相关，但测量基因抑制似乎对体外实验很重要。

3.2 内化和跟踪

AOC的内化和跟踪可以通过用荧光基团或其他跟踪剂标记寡核苷酸来完成（图13）。AOC的内化通常容易观察到，但逃离溶酶体却复杂多变。对不同靶点和沉默活动的研究发现，即使都内化了，也不会导致所有靶点沉默。共聚焦显微镜研究显示AOC和LAMP2有很强的共定位，这表明是通过内体途径进行的。我们推测，溶酶体加工和/或逃逸的差异可以显著改变靶点之间的活性。这进一步证实了一些靶点可能需要鱼精蛋白或其他溶酶体逃逸剂来增加AOC的活性的观点。从体外研究来看，溶酶体逃逸似乎是开发AOC时的一个重要考虑因素，也是选择靶点和构建设计的一个主要考虑因素。

图 13. 含荧光基团的AOC

3.3 细胞毒性

细胞毒性是肿瘤学中用来测量阻止分裂和杀死细胞能力的一个重要指标。由于 AOC正在遗传疾病和肿瘤学中进行研究，细胞毒性测定可能不是活性的最佳测量方法。 AOC的半抑制浓度一般在纳摩尔范围内，而ADC的半抑制浓度大多在皮摩尔范围内。 这种活性上的差异可能是由于缺乏溶酶体逃逸、 转运差异或稳定性差异。寡核苷酸的靶向也可能很重要，一些细胞可能比其他细胞对基因的沉默更敏感。无论原因如何，抗体靶点的选择都必须与AOC的活性相匹配。一种阿霉素插入的西妥昔单抗AOC对EGFR+细胞系的活性是游离阿霉素的2.7-7倍。使用DM1和MMAE对Her2靶向寡核苷酸进行的体外细胞毒性试验显示，与常规ADC相比，具有相似的活性和特异性。一项使用含有曲妥珠单抗MMAE的AOC进行的实验显示了个位数的纳摩尔活性，但仍然比类似的ADC低10倍左右。在这两个例子中，抗体是不同的，但都针对表达Her2的细胞系，并包含不同的可切割的MMAE寡核苷酸结构。这说明，即使释放相同的MMAE分子，具有相同的释放机制，其寡核苷酸的化学性质也会影响其活性。

3.4 稳定性

由于寡核苷酸在血浆中的半衰期较短，因此其在血液中的稳定性问题是一个重要的考虑因素。一项基于DNA的AOC研究表明在人血浆中的半衰期（5.7天）比单独的寡核苷酸半衰期（1.9天）增加了两倍。一种鱼精蛋白的西妥昔单抗寡核苷酸在血清中22小时后显示出稳定性。早期的体外稳定性研究表明，AOC的寡核苷酸部分确实显示出足够的稳定性，可以在体内给药，并具有药理活性。