监测细胞内生物标志物对于临床疾病诊断至关重要。然而，大多数信号分子在跨细胞膜传输至细胞内检测位点时面临传输缓慢的困难，限制了其在临床中的应用。本研究提出了一种基于人工细胞的信号探针传输增强传感策略，通过将碳纳米管（CNTs）嵌入人工细胞膜中，有效检测微小RNA（miRNAs）。基于脂质体的人工细胞被构建用于保护核酸、金属离子和荧光染料等信号探针。碳纳米管嵌入人工细胞膜中，作为人工通道增强细胞间信号探针的传导和传质。通过碳纳米管介导的细胞间信号探针传输，探针穿过脂质体膜界面并融合到靶细胞中，选择性地与细胞内靶标miRNAs杂交，触发传感过程并产生增强的荧光信号。此外，分子动力学模拟证明了碳纳米管介导的细胞间融合的增强作用。该策略通过定量检测let-7a miRNA并在活体结肠癌细胞中可视化，展示了优异的分析性能。这些发现对促进和加速细胞间信号探针传输以及实现细胞内生物标志物的有效传感用于诊断具有重要意义。
获取和监测细胞质生物标志物如微小RNA（miRNAs）对于疾病诊断至关重要，但在活细胞中检测这些标志物面临着极大挑战，特别是细胞内外环境的干扰。为解决这一问题，脂质体基人工细胞（ArtifCells）被广泛应用于生物传感和药物递送系统。然而，由于膜通透性、细胞环境及细胞骨架的限制，ArtifCell与目标细胞的融合效率较低，影响了信号探针的传输效果。
为改善细胞间物质递送，研究提出将碳纳米管（CNTs）嵌入脂质膜，作为有效的分子通道促进信号探针和离子的转移。嵌入的CNTs帮助信号探针穿越脂质体膜与邻近细胞融合，从而实现目标miRNA的检测。例如，let-7a与核酸探针结合，形成依赖镁离子的DNA酶，释放富含鸟嘌呤的G四链体，显著增强荧光信号。这一增强的信号使得miRNA的灵敏检测成为可能。
本研究还通过计算模拟验证，嵌入CNTs的ArtifCell有效促进了细胞融合，增强了信号探针的传输。该系统首次将CNTs作为分子通道加速ArtifCell到真实细胞的探针转移，具有在复杂生理环境中进行生物标志物监测的巨大潜力。
图 1. 基于ArtifCell@CNTs的探针传输增强传感策略示意图。a)
碳纳米管的纯化及用于荧光传感的ArtifCell@CNTs的制备。
b)
ArtifCell@CNTs特异性靶向let-7a的传感示意图。
图 2. 碳纳米管及ArtifCell@CNTs的制备与表征。a)
未纯化碳纳米管的透射电子显微镜（TEM）图像，
b)
碳纳米管的热重分析图像。比例尺：500 nm。
c,d)
纯化、磷脂包覆、切割和分离后的碳纳米管的TEM图像。比例尺：1 µm 和 200 nm。
e)
用于制备ArtifCells的微流控通道示意图。
f)
倒置光学显微镜下的微流控芯片通道（LO：携带脂质的有机相，OA：外水相，IA：内水相）。比例尺：100 µm。
g)
倒置光学显微镜下ArtifCells的形成过程。比例尺：100 µm。
h)
未嵌入碳纳米管的ArtifCells的TEM图像。比例尺：100 nm。
i,j)
ArtifCell@CNTs的TEM图像。比例尺：200 nm 和 100 nm。
k)
ArtifCell@CNTs的示意图。
l)
嵌入0.4 mg mL−1碳纳米管的多重ArtifCells的高分辨透射电子显微镜（HRTEM）图像。（图中大面积的白色区域是由于磷钨酸负染色效果不佳所致）。
图 3. ArtifCells与ArtifCell@CNTs的融合。a)
ArtifCell@CNTs与未嵌入碳纳米管的ArtifCell 2融合过程的示意图。
b)
ArtifCell@CNTs用磷脂特异性罗丹明B染料染色（红色），未嵌入碳纳米管的ArtifCell 2用钙黄绿素染色（绿色）。在全内反射显微镜下观察融合过程。比例尺：20 µm。
c)
嵌入0.1、0.2、0.4 mg mL−1及过量碳纳米管的ArtifCells的高分辨透射电子显微镜（HRTEM）图像。
d)
展示碳纳米管促进ArtifCells融合过程的HRTEM图像。
e)
通过荧光猝灭法验证融合过程的示意图。
f)
分析ArtifCells及嵌入不同浓度碳纳米管的ArtifCells融合过程中荧光强度（RFU）相对于初始荧光值的变化百分比及其与动力学速度的相关性。
g)
ArtifCells及嵌入不同浓度碳纳米管的ArtifCells融合过程的实时荧光监测及一级反应动力学拟合。
h)
ArtifCells及嵌入不同浓度碳纳米管的ArtifCells融合过程的实时荧光监测及二级反应动力学拟合。
图 4. 嵌入ArtifCells的碳纳米管介导的离子传输。a)
嵌入的碳纳米管作为人工离子通道加速离子传输的示意图。
b)
添加Mg2+前后，测量包裹在嵌入或未嵌入碳纳米管的ArtifCells中的铬黑T的紫外-可见吸收光谱。结果为三次重复实验的平均值±标准差（SD）。采用T检验进行统计分析，星号表示显著性水平（*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001）。
c)
通过AAO膜与ArtifCell@CNTs结合形成的复合结构中碳纳米管通道进行离子传输的示意图。
d)
用于测量纳米通道I-V曲线的电化学装置示意图。
e)
AAO膜在未涂层、ArtifCells涂层、碳纳米管涂层、ArtifCell@CNTs涂层及ArtifCells与碳纳米管物理混合（ArtifCell + CNTs）情况下的I-V曲线（实验条件：1 M MgCl2作为电解质；10 mg mL−1 ArtifCells；100 nm长度，0.4 mg mL−1碳纳米管）。
f)
Mg(H2O)62+、
g)
Mg(H2O)52+、
h)
Mg(H2O)42+及
i)
Mg2+离子通过碳纳米管作为离子通道进入ArtifCell@CNTs膜的分子动力学（MD）模拟。
j)
离子与碳纳米管端口之间的距离随时间的变化。
k)
不同离子通过ArtifCell膜的势能。
l)
ArtifCell@CNTs膜的自由能及
m)
表面自由能。
图 5. 基于ArtifCell@CNTs的传感策略的分析性能。a)
荧光强度放大的可行性分析。
b)
圆二色性的可行性分析。
c)
不同浓度靶标let-7a的荧光光谱。
d)
校准曲线及线性范围，展示荧光强度与不同浓度let-7a的相关性。
e)
该策略对多种miRNAs的特异性分析，其中let-7a浓度为1 nM，其他miRNAs浓度为10 nM。
f)
通过本方法（绿色）和实时定量聚合酶链反应（RT-qPCR）方法（红色）测定的健康个体和患者血清样本中let-7a相对表达水平的对比图。结果为三次重复实验的平均值±标准差（SD）。采用单因素方差分析（图5e）和T检验（图5f）进行统计分析，星号表示显著性水平（*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001）。
图 6. 碳纳米管促进ArtifCell与细胞融合的验证。a)
在全内反射荧光显微镜下观察ArtifCell@CNTs的融合过程，并观察未嵌入碳纳米管的ArtifCells融合过程的阴性对照。比例尺：10 µm。
b)
ArtifCell@CNTs与靶标ArtifCell融合过程的示意图。
c)
未嵌入碳纳米管的ArtifCells与细胞融合过程的粗粒化分子动力学（MD）模拟。
d)
ArtifCell@CNTs与细胞融合过程的粗粒化MD模拟。
e)
分析ArtifCells和ArtifCell@CNTs的势能随时间的变化，以及ArtifCell或ArtifCell@CNTs与细胞中心距离随时间的变化。
f)
ArtifCell内部粒子与细胞之间交换数量的比例。
图 7. 通过使用当前的ArtifCell@CNTs基础策略监测和检测活细胞中的miRNA。a)
经过与ArtifCell@CNTs孵育后（有无添加离子）HCT 116细胞的荧光成像。
b)
经过与无CNTs的ArtifCells孵育后，以及与含PBS、0.1、1和10 nM let-7a的ArtifCell@CNTs孵育12小时后的HCT 116细胞荧光成像。比例尺，100 µm。
c)
ArtifCell@CNTs与结肠癌细胞融合过程的示意图。
d)
使用提出的ArtifCell@CNTs基础策略绘制的标准曲线，平均灰度值与let-7a水平的关系。x轴表示HCT 116细胞中let-7a的含量。结果为三次重复样本的均值±标准误差。
在本研究中，构建了一种有效的探针转运增强型ArtifCell@CNTs传感器。为了有效监测细胞内信号生物标志物，利用CNTs嵌入ArtifCells的膜中，作为人工通道，增强了ArtifCell@CNTs与靶细胞之间的细胞间探针转导，从而实现了生物活细胞成像。通过微流控芯片将核酸探针、金属离子和荧光染料包封在ArtifCells的磷脂层内，以保护信号分子。得益于后者在复杂生理环境中的保护作用，以及ArtifCell膜上嵌入的CNTs，融合过程得以加速，ArtifCells之间的离子和信号转运得到了增强。动力学曲线表明与一阶和二阶反应模型均吻合。这种增强使得ArtifCell@CNTs可以作为细胞靶向传感器，用于在细胞内微环境中监测miRNAs。通过将该传感器作为miRNA传感工具，其在真实血清样本中准确、定量检测let-7a的能力得到了验证。该系统消除了复杂生物环境中基质效应，展现了出色的分析性能（低LOD适用于真实血清样本分析），且具有宽线性范围。然而，仍然认为可以通过采用替代放大技术、利用不同的合成探针或整合未来新兴的先进测量方法进一步提高LOD。这些将需要在开发更智能和更新的传感技术以及探测器方面做出额外努力。此外，MD模拟数据表明，ArtifCell@CNTs组的潜能随着时间的推移变弱，ArtifCell@CNTs与细胞之间的物质交换速率更高。MD模拟确认，将CNTs嵌入ArtifCell模型有效地增强了细胞间融合，相比于无CNTs的模型。提出的ArtifCell@CNTs基础策略巧妙地解决了信号分子和离子从溶液到细胞的转运问题，实现了miRNAs在活细胞中的检测和可视化。这些发现为ArtifCell在复杂生理研究中的生物分析和生物成像应用开辟了潜在的应用前景。总的来说，本研究为通过基于CNTs的人工通道开发细胞间通信传感器提供了一条有前景的途径，能够有效介导探针转运和膜融合，在生理环境中高效地感知生物标志物。
