一种用于类器官的功能化生物活性硅酸钙纳米线水凝胶

类器官是一种三维多细胞结构，近年来引起了人们的极大关注。目前类器官的培养方式主要包括天然和合成聚合物水凝胶。来自中国科学院上海硅酸盐研究所的吕宏旭教授、吴成铁教授团队开发了一种由硅酸钙（ CS ）纳米线和甲基丙烯酸明胶（ GelMA ）组成的复合水凝胶，具有诱导肠道和肝脏类器官形成以及作为功能化底物的潜力，并进一步探讨了 CS 纳米线促进类器官结构形成和发育的机制。研究发现 CS 纳米线可以影响水凝胶的刚度，从而调节机械感觉因子 yes 相关蛋白（ YAP ）的表达，且 CS 纳米线在培养基中释放的生物活性离子可加速 Wnt/ ꞵ-catenin 信号传导，进一步促进类器官发育。此外，生物活性离子还能增强肠道类器官的营养吸收和 ATP 代谢活性。

研究者通过水热法合成了 CS 纳米线， XRD 结果表明，制备的 CS 纳米线具有较高的结晶度（图 1b ），其衍射峰与 Ca ₆ Si ₆ O ₁₇ （ OH ） ₂ 的衍射峰吻合良好，长度约为几微米，直径约为 10-50 nm （图 1c ， d ） 。为了验证 CS 作为肠道类器官培养的功能化底物，分别将 5% GelMA 分别与 1% ， 2% ， 4% 的 CS 混合进行肠道类器官培养，然后又加入了 10% 基质胶以提高肠道类器官的培养效率，通过与纯基质胶培养的肠道类器官进行对比，发现 GelMA-2CS-10M 组在第五天时，类器官形成效率能够与基质胶相媲美（图 1e-h ）。

然后，研究了优化后 CS/GelMA 水凝胶是否支持肠道类器官分化。成熟肠道上皮包含典型的分化细胞类型，包括存在于隐窝中的肠干细胞（标记物： Lgr5 ）和潘氏细胞（标记物：溶菌酶），分杯状细胞（标记物：粘蛋白 -2 ）和肠内分泌细胞（标记物：嗜铬粒蛋白 -A ）。结果显示：与其他三组（ GelMA 、 GelMA-10M 、 GelMA-2CS ）比较， GelMA-2CS-10M 组中的四种细胞标志物在肠道类器官中总体表达水平更为显著（图 2a-e ）。基因表达结果也与上述结果一致。随后研究者对 GelMA-2CS-10M 支持的肠道类器官的功能腔、分泌功能以及传代培养功能进行评估，结果显示，优化后的 CS/GelMA 水凝胶能够培养和促进肠道类器官分化，其结构和功能特性与 Matrigel 产品相当（图 2f-i ）。

接下来，研究者探究了 CS/GelMA 水凝胶支持类器官发育的机制。 Yes 相关蛋白（ YAP ），对肠干细胞的自我更新和增殖至关重要，已有研究报道张力可增强肠上皮细胞 YAP 的核易位和活化。肠道类器官的 YAP 活化与所在的水凝胶的力学性能有关。荧光染色显示， GelMA 组在第 1 天出现 YAP 核易位的细胞比例最高（图 3b ）。培养 3 d 时， GelMA-2CS-10M 中 YAP 入核的细胞比例高于其他组（图 3c ）。第 5 天时，各组肠道类器官中 YAP 入核的细胞比例相似（图 3d ）。但整个过程中，在基质胶中的 YAP 入核细胞比例都高于优化后的 CS/GelMA 水凝胶。研究者并采用流变学测试进一步验证上述结果。以上研究表明，基质的刚度有利于细胞早期 YAP 的核易位，进而促进肠道干细胞的增殖。

作为无机生物活性材料，硅酸钙通过释放生物活性离子调节干细胞的行为，显示出优越的生物效应。研究者利用细胞增殖实验筛选出两种合适 CS 浓度： 50 mg/mL ， 100 mg/mL （图 4a ） 。然后检测相关基因表达以及荧光染色来评估生物活性离子对干细胞的影响（图 4b-d ），发现 CS 纳米线对肠道类器官发育的影响在培养 3 天时最为显著，表明 CS 纳米线的添加有望缩短肠道类器官发育成熟的时间。

随后研究者又探讨了生物活性离子促进肠道类器官发育的机理。 Wnt/β-catenin 信号通路对肠道干细胞的增殖和分化至关重要，是隐绒毛结构形成不可或缺的调控途径。结果显示生物活性离子对 Wnt/β-catenin 信号的影响是支持肠道类器官发育的主要原因。同时，生物活性离子增强肠道类器官的葡萄糖吸收和 ATP 活性，进一步促进了肠道类器官的发育（图 5 ）。

为了验证了 CS/GelMA 复合水凝胶作为类器官培养底物的通用性和适用性，研究者建立小鼠肝类器官培养模型，利用优化后的 CS/GelMA 水凝胶促进肝类器官生长。用 GelMA-2CS-10M 水凝胶和基质胶分别培养 1 、 3 、 5 天的肝类器官显微照片如图 6a 所示。 H&E 染色结果也显示，两组培养的肝类器官均呈现典型的中心腔和周围上皮的结构（图 6b ）。随后，利用免疫荧光染色评估了成熟肝细胞标志物白蛋白（ ALB ）、 CYP3A4 和胆管细胞特异性标志物 CK19 的表达，结果显示，与基质胶组相比， GelMA-2CS-10M 水凝胶中的肝类器官 能够正常表达 ALB 、 CK19 和 CYP3A4 （图 6c-d ） 。此外， GelMA-2CS-10M 水凝胶中的肝类器官还能合成糖原和脂质等（图 6e ）。

本研究由来自中国科学院上海硅酸盐研究所的吕宏旭教授、吴成铁教授团队合作完成，并于 2024 年 3 月发表于 Materials Horizons 。

论文信息： Ma. W, Zheng. Y, Yang. G, Zhang. H, Lu. M, Ma. H, Wu. C*, Lu, H*. A bioactive calcium silicate nanowire-containing hydrogel for organoid formation and functionalization. Materials Horizons 2024, 11: 2957-2973.

原文链接： https://doi.org/10.1039/d4mh00228h

供稿：刘大川

审校：袁章琴

编辑：林志