本文主要讨论了关于国自然中最难的部分——分子机制的问题，重点阐述了临床专业申请人在研究细胞分子机制时所面临的深度要求，并以一个关于A基因影响线粒体自噬的实例来详细解释分子机制研究的层次和步骤。
临床专业申请人在研究分子机制时面临的主要困难包括认识的多样性、方向代码下的深度要求等。研究分子的深度可以从表型检测、具体途径确定、靶点筛选等角度分为多层进行研究。
文章以A基因影响线粒体自噬为例，详细解释了分子机制研究的六个层次，包括表型相关指标检测、确定具体通路、筛选确认通路的靶点等。
文章以一个具体的故事化例子展示了如何通过研究分子机制揭示基因A的作用机制，并通过临床相关性提升研究成果的应用价值。
对大部分临床专业的申请人来说，国自然中最难的地方是
分子机制
，原因多样：
比如大家对分子机制的认识不同，即使是评审专家也没有固定统一的看法，更重要的是在不同的方向代码下，对细胞分子机制的深度要求也不同
，下面我们就这个问题展开说一下。
总的来说，机制的深度可以分为
6
层（个人观点），但并不代表所有代码下的研究都需要做完。
细胞与分子机制的起点是表型和通路指标的检测，所以指标检测是必做部分。比如
前期预实验中发现
A
基因促进了细胞线粒体自噬
，除了通过电镜、显微镜等形态确定外，还需要检测细胞自噬以及线粒体自噬关键的指标，比如
LC3-II/LC3-I
比值、
p62
、
ATGs
等，但需要注意的是：
由于细胞自噬的方式很多，因此不仅要检测上述自噬指标，还需要检测线粒体自噬特异性的指标，比如
PINK/Parkin
、
FUNDC1
和
BNIP3/NIX
等等
。
这一步完成后可以得到的初步结论是：
A
基因改变了线粒体自噬相关指标表达，是对其它结果（如形态学）的进一步确认，也是下一步的起点。
第二层：具体那条通路或者途径发挥作用（依赖于哪种方式）？
承接上一层结果，
我们知道细胞凋亡有多种途径或者方式（比如
Caspase-9
、
FAS
和
BCL2
、
BAD
等），类似的细胞铁死亡也有几种方式（如铁离子、脂质过氧化和谷胱甘肽等），而线粒体自噬也有几种（
PINK1-Parkin
通路、
FUNDC1
和
BNIP3/NIX
等），因此在第一层的基础上就需要
确定到底是哪种方式、通路或者途径，检测手段一般还是以
WB
这些常规方法为主。
这一步完成后可以得到的初步结论是：
A
基因通过
PINK1-Parkin
途径（而非
FUNDC1
和
BNIP3/NIX
等）促进线粒体自噬，当然如果
PINK1-Parkin
途径在
A
基因促进线粒体自噬中发挥非常高的占比，那我们可以说
A
基因依赖于
PINK1-Parkin
途径（而非
FUNDC1
和
BNIP3/NIX
等）促进线粒体自噬。
承接上一层结果，既然确认了
A
基因激活
PINK1-Parkin
途径，那
A
基因具体是如何激活这条通路的呢？
一般情况下我们就要做免疫共沉淀、
ChIP-Seq
、
RIP-Seq
、
RNA pulldown
等实验了（
具体的实验要根据
A
的分子特性来选择，比如
A
的生化特性和细胞定位、结构域分析等等
），这些实验大致分“
筛选和验证
”两部分，所以筛选部分一般是测序等高通量组学方法，验证部分一般是
WB
、
PCR
等低通量手段，筛选的一般原则是“
1
）哪些靶点与
PINK1-Parkin
途径有关；
2
）能解释
A
基因激活
PINK1-Parkin
途径的作用”，当然最好的就是
A
基因直接调控
PINK1-Parkin
，不过多数情况下都筛选不到，这样就需要在
A
和
PINK1-Parkin
之间再找一个
B
分子，即
文献报道
B
如何调控
PINK1-Parkin
，而数据显示
A
可能调控
B
，所以
A
可能通过
B
调控
PINK1-Parkin
通路。
一般情况下，
B
可能会有很多个：
B1
、
B2
、
B3
……，所以就还需要进一步验证，比如对
A
进行免疫共沉淀（
Co-IP
）
+
质谱筛选到
B1
、
B2
、
B3
，验证就反过来做
B1
、
B2
、
B3
与
A
的
Co-IP
。需要注意的是：
如果我们说
A
通过
B2
激活
PINK1-Parkin
途径，到这里还不够，还需要做挽救实验，把
B
敲掉（或者阻断）后，
A
激活
PINK1-Parkin
途径的作用是不是被大大降低，甚至是完全没有了？
反之，把
A
敲掉（或者阻断）后，
B
激活
PINK1-Parkin
途径的作用是不是被大大降低，甚至是完全没有了？
（
这里大家思考一下为什么还要把
A
敲掉或者阻断
）。
同样的道理，我们就说
A
依赖于
B
激活
PINK1-Parkin
途径，这一步完成后可以得到的初步结论是：
A
通过（依赖于）靶点
B
激活
PINK1-Parkin
途径，下面一个问题是：
A
是如何影响靶点
B
的？
承接上一层结果，既然
A
通过靶点
B
发挥作用，而
B
在文献中可以激活
PINK1-Parkin
途径，那
A
是如何影响
B
蛋白的呢？（
其它方式作用，比如
A
影响
B mRNA
等就不展开说了，是一个道理。
）既然我们发现
A
和
B
是两个蛋白相互作用，那就考虑蛋白层面的影响了，所以我们先看
A
对
B
蛋白表达的影响，还是做
WB
看总蛋白就行；假如我们发现
A
沉默后，
B
的蛋白总量减少了，那我考虑是不是
A
影响了
B
蛋白的稳定性（
由于
B
蛋白的产生是
mRNA
翻译的结果，而前面并没有考虑蛋白
A
与
B mRNA
的结合影响，所以这里不探索，但不排除有影响
）。
到蛋白稳定性大家就熟悉了，先做一个半衰期实验，
发现
A
蛋白沉默后
B
蛋白在细胞内的半衰期缩短了，就可以考虑
A
可能是提高
B
蛋白稳定性的，那影响稳定性的原因有哪些呢？
多泛素化介导的蛋白酶体途径降解、溶酶体介导的蛋白降解等等，下面就做两个：
看看蛋白酶体和溶酶体降解抑制剂处理是不是解除了
A
沉默对
B
蛋白稳定性的影响，从而确定哪种方式
（是不是跟第二层有些像？），再检测一下
B
蛋白的泛素化水平，如果发现泛素化有改变，那就大致上可以说
:
A
蛋白通过
B
蛋白的泛素化
-
蛋白酶体途径（或者溶酶体途径）提高
B
蛋白的稳定性了。
那如果
A
蛋白并没有影响
B
蛋白的稳定性呢？
那就看看
B
蛋白的定位、其它翻译后修饰（磷酸化等等……）
这些
，
如果定位或者其它翻译后修饰有影响，也可以继续沿着定位的思路、或者翻译后修饰的思路来说……
这一步完成后可以得到的初步结论是：
A
蛋白通过
B
蛋白的泛素化
-
蛋白酶体途径（或者溶酶体途径）提高
B
蛋白稳定性和表达，那
A
具体是如何影响
B
蛋白的呢？
第五层：
A
与靶点
B
的作用方式是直接还是间接的？
承接上一层结果，
A
蛋白降低了
B
蛋白的泛素化水平，这个结果具体是如何发生的呢？
A
作为泛素连接酶或者去泛素化酶直接对
B
（去）泛素化呢，还是
A
（作为脚手架蛋白）招募了泛素连接酶或者去泛素化酶
C
，从而对
B
（去）泛素化呢？
接着做体外蛋白互作实验，假定我们有个很有意思的发现：
经典观点认为
A
是一个转录因子，一般情况下，
A
可以调控
mRNA
转录发挥功能
（
但发挥这个作用就需要
A
跑到细胞核里面
）；但是我们的数据发现：
A
在细胞浆里面的时候（细胞定位数据支持）居然还能招募去泛素化酶
C
与
B
结合，这样
C
就能把
B
的泛素化水平降下来，从而提高
B
蛋白的稳定性。
这一步完成后可以得到的初步结论是：
细胞浆里面的
A
蛋白不作为转录因子发挥功能，而是招募去泛素化酶
C
和
B
蛋白，降低
B
蛋白的泛素化水平并提高其稳定性。
第六层：
A
的哪个位点对招募去泛素化酶
C
和
B
蛋白发挥关键作用？
承接上一层结果，下面的问题就是
做
A
结构域的分析，蛋白间分子对接、构建
A
结构域和关键氨基酸位点（比如
K162
）的缺失，看结构域和关键氨基酸突变对
A
结合
B
、
C
的影响，以及对
B
蛋白稳定性和泛素化水平的影响以及对
PINK1-Parkin
途径、对线粒体自噬的影响……
，结果我们发现
A
蛋白中
162
位的
K
这个氨基酸突变后，
A
还能结合
B
，但是并不能招募去泛素化酶
C
了，这样
A
对
B
的影响就没有了。
到这里，机制部分就基本上讲完了，我们先做简单总结：
一般情况下，除了第六层以外，基本都要做（当然有的代码下不需要，比如研究中药复方……）
。大家可能也感觉到了，
做了这么多，我们才能得到一个
A
通过
C
调控
B
的
初步结论
，为了验证这个初步结论还有很多很多实验，那大家可以想一下，
如果要验证的是
A
通过
B
调控
C
在影响
D
以后激活
PINK1-Parkin
途径和线粒体自噬，要做的实验能有多少……
机制完成后，我们提升一下临床意义。假如我们有一个很好的发现：
A
蛋白中
162
位的
K
对应的核酸位点居然在
S
这个疾病中是高风险位点
，这样我们就可以讲这么有意思的故事：
疾病中
A
蛋白有个高风险位点（对应的是
K162
），由于经典观点认为蛋白
A
是个转录因子，所以下游
mRNA
的转录谱结果一直没法解释为什么
A
突变会抑制细胞自噬。
所以我们开展了以上研究，结果发现正常情况下，
A
蛋白通过其作为脚手架蛋白（而非转录因子）招募去泛素化酶
C
和蛋白
B
，降低蛋白
B
的泛素化水平提高
B
蛋白稳定性，从而激活
PINK1-Parkin
途径和促进线粒体自噬，发挥保护作用
；但是
由于
K162
氨基酸位点突变，
A
只能结合
B
不能招募
C
了，这样
B
就会被过度降解（因为
B
的泛素化
-
去泛素化平衡被打乱了），导致
PINK1-Parkin
途径和线粒体自噬不能被活化，从而出现细胞死亡和组织损伤，从而出现对应的病理特征。
最后既然
A
的
K162
突变是核心氨基酸位点，我们把这个位点通过基因治疗手段或者设计小分子药物让
A
能够再招募去泛素化酶
C
和蛋白
B
，最后发现疾病改善了……
故事逻辑可能还要再完善一下细节。
最后，大家觉得编的这个故事能发到什么档次的期刊上？老板打算试试大子刊，你们觉得有戏么？
基金申请或者课题思路讨论合作
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